两株红树内生真菌共培养正丁醇萃取部位化学成分研究

将来自南海红树林内生真菌E33和K38的共培养,从该培养液正丁醇萃取物中分离到环(L-苯丙-L-脯)二肽(1),环(D-脯-L-苯丙)二肽(2),环(L-苯丙-反-4-羟基-L-脯)二肽(3),环(顺-4-羟基-D-脯-L-苯丙)二肽(4),环(L-脯-L-酪)二肽(5),环(D-脯-L-酪)二肽(6),环(D-脯-D-色)二肽(7),木糖醇(8),腺苷(9),尿苷(10),其中化合物6为首次从真菌中分离到,化合物2,6,7,8为首次从海洋真菌里获得。     

海洋放线菌Streptomyces novaecaesareae次生代谢产物

对南海来源链霉菌Streptomyces novaecaesareae的次级代谢产物进行研究,经多种柱色谱技术分离得到10个化合物,通过波谱学方法并结合文献数据比对鉴定其结构分别为:环(4-羟基-L-脯-D-苯丙)二肽(1)、环(4-羟基-L-脯-L-苯丙)二肽(2)、环(4-羟基-L-脯-D-脯)二肽(3)、环(4-羟基-L-脯-L-亮)二肽(4)、环(L-脯-L苯丙)二肽(5)、环(L-亮-L-脯)二肽(6)、环(D-脯-L-亮)二肽(7)、环(8-羟基-L-脯-D-异亮)二肽(8)、N-(4-氧代戊基)-乙酰胺(9)和邻苯二甲酸二丁酯(10)。化合物1-9为叶立德类化合物,且1、3和7含有自然界中不常见的D构型氨基酸。所有化合物均首次从Streptomyces novaecaesareae中分离得。     

南海珊瑚内生细菌Pelomonas puraquae sp.nov(B-2)中环二肽类次生代谢产物研究

为了研究珊瑚内生细菌Pelomonas puraquae sp.nov(B-2)次生代谢产物,采用现代分离纯化方法对其发酵液和菌丝体的次生代谢产物进行分离、纯化,得到8个单体化合物。通过现代波谱分析(1D NMR和MS等)和物理常数对照等方法对其进行结构鉴定,均为环二肽类物质,依次为:环(羟脯-苯丙)二肽(1)、环(脯-酪)二肽(2)、环(苯丙-甘)二肽(3)、环(苯丙-丙)二肽(4)、环(丙-酪)二肽(5)、环(亮-甘)二肽(6)、环(甘-缬)二肽(7)、环(丙-缬)二肽(8)。所有化合物均首次从该细菌中分离得到。     

一株南海珊瑚细菌L-4抗肿瘤活性次生代谢产物研究

在研究珊瑚微生物混合共培养时发现:在混合培养中南海珊瑚内生细菌L-4对真菌的次生代谢产物明显产生影响,甚至产生此二微生物单独培养时所不产生的物质。对L-4发酵液进行次生代谢产物研究,从中分离纯化得到8个单体化合物,通过现代波谱分析(MS、NMR等)和物理常数对照等手段确定其结构依次为:环(色-丙)二肽(1)、环(甘-酪)二肽(2)、环(丙-酪)二肽(3)、环(缬-酪)二肽(4)、环(甘-苯丙)二肽(5)、环(甘-脯)二肽(6)、环(丙-缬)二肽(7)、环(甘-丙)二肽(8)均为环二肽类物质,且均首次从南海珊瑚内生细菌中分离得到,对进一步研究其可能的代谢机制具有重要意义。     

环（L-丙-L-脯）二肽的合成

以L-(+)-丙氨酸和N-叔丁氧羰基-L-(+)-脯氨酸为原料,分别经中和、缩合、脱保护、环化反应后,以65.3%的总产率合成得到了新型催化剂环(L-丙-L-脯)二肽,结构经IR、1HNMR、13CNMR、元素分析等表征.     

一株南海珊瑚细菌L-4抗肿瘤活性次生

 在研究珊瑚微生物混合共培养时发现：在混合培养中南海珊瑚内生细菌L-4对真菌的次生代谢产物明显产生影响,甚至产生此二微生物单独培养时所不产生的物质。对L-4发酵液进行次生代谢产物研究,从中分离纯化得到8个单体化合物,通过现代波谱分析（MS、NMR等）和物理常数对照等手段确定其结构依次为：环（色-丙）二肽（1）、环（甘-酪）二肽（2）、环（丙-酪）二肽（3）、环（缬-酪）二肽（4）、环（甘-苯丙）二肽（5）、环（甘-脯）二肽（6）、环（丙-缬）二肽（7）、环（甘-丙）二肽（8）均为环二肽类物质,且均首次从南海珊瑚内生细菌中分离得到,对进一步研究其可能的代谢机制具有重要意义。     

红树林内源真菌2524号的肽类成分(Ⅰ)

采自香港的红树林内源真菌 (No 2 5 2 4)能产生丰富的肽类代谢产物 ,从培养液的乙酸乙酯提取物中分离出 5个环二肽 :环 (酪_亮 )二肽 ,环 (苯丙_丙 )二肽 ,环 (丙_缬 )二肽 ,环 (脯_甘 )二肽和 5_异丁基_2 ,4_二酮咪唑烷。它们的结构通过IR ,FABMS ,NMR以及 2DNMR得到确定     

环（L-丙-L-脯）二肽的合成

以L-(+)-丙氨酸和N-叔丁氧羰基-L-(+)-脯氨酸为原料,分别经中和、缩合、脱保护、环化反应后,以65.3%的总产率合成得到了新型催化剂环（L-丙-L-脯）二肽,结构经IR、1HNMR、13CNMR、元素分析等表征。     

手性环(L-苯丙-L-组)和(D-苯丙-D-组)二肽的合成

环二肽是不对称氰醇化反应的重要催化剂。以L-苯丙氨酸、L-组氨酸和D-苯丙氨酸、D-组氨酸为原料，用苄氧羰基保护苯丙氨酸的N端和进—步用硝基苯酚酯活化其C端，再与C端保护的组氨酸甲酯缩合，得直链二肽，再经Pd／C催化氢化脱保护基，闭环，得环(L—苯丙—L—组)二肽和(D—苯丙—D—组)二肽，结构经元素分析、IR、HNMR等证实。     

柳珊瑚共生菌Bucillus methylotrophicus发酵液化学成分研究

【目的】研究柳珊瑚Anthogorgia caerulea共生细菌Bacillus methylotrophicus发酵液中的化学成分。【方法】采用多种柱色谱和高效液相色谱分离技术,对柳珊瑚A.caerulea共生菌B.methylotrophicus发酵液中化学成分进行研究,运用理化和波谱分析方法鉴定其化学结构。【结果】从共生细菌B.Methylotrophicus发酵液中分离了6个化合物,分别鉴定为环(脯-甘)二肽(1)、环(S-脯-R-亮)二肽(2)、胸苷(3)、尿苷(4)、原儿茶酸(5)、3-Furancarboxylic acid-5-(hydroxmenthy)-Furan(6)。【结论】化合物1~6均是首次从该种细菌中分离得到,丰富了柳珊瑚共生菌B.methylotrophicus的化学多样性。     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

GPR41稳定细胞株的建立及受体激动剂筛选

构建GPR41稳定细胞株,从RNA、蛋白水平验证了GPR41的表达并利用cAMP和钙流检测验证了GPR41的生物活性.实验结果表明,该细胞株可以用于筛选受体激动剂.从海藻来源的黄曲霉中提取到的次级代谢产物用于筛选GPR41的激动剂.实验结果还表明,2-吡喃酮类化合物(37号)在1μmol/L浓度条件下即可具有GPR41受体激动活性.这是首次报道2-吡喃酮类化合物具有GPR41受体激动活性.     

抗癌胚抗原纳米抗体与人Fc融合蛋白在毕赤酵母和HEK293细胞中的表达、纯化和性质比较

通过对不同系统表达的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)纳米抗体与人Fc融合蛋白(11C12-Fc)的表达、纯化及抗体性质等的比较分析,比较不同表达系统的特点及其对融合抗体性质的影响;从而为CEA融合纳米抗体在体内检测方面的应用提供理论依据。构建两种11C12-Fc表达系统(Pichia pastoris和HEK293)相应的表达载体和菌株,分别进行诱导表达、分离纯化;并对其纯化产物的生物学活性等进行初步研究。成功构建了毕赤酵母、HEK293细胞两种CEA纳米抗体融合蛋白(11C12-Fc)表达系统并实现11C12-Fc的胞外分泌表达;通过protein A柱及阴离子交换层析纯化,获得了较高纯度和浓度的11C12-Fc样品;通过突变糖基化位点的方式有效去除了毕赤酵母表达11C12的过度糖基化作用;并且其抗体亲和力较突变前未发生明显改变,与HEK293细胞表达的11C12-Fc都表现出较高的亲和力。毕赤酵母和HEK293系统均能够表达具有较高生物活性的11C12-Fc,后续的科研或生产可根据实际需要和条件来合理选择表达系统。为后续的纳米抗体融合蛋白规模化生产、体内诊断与靶向治疗的应用提供了理论和技术参考。     

CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用

建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。     

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达.从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle-G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western-blot进行鉴定.酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX-G1S0.7; ELISA检测结果和Western-blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NP mAb特异性结合.说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据.     

Induction of photosensitivity by heterologous expression of melanopsin

Melanopsin has been proposed to be the photopigment of the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (ipRGCs); these photoreceptors of the mammalian eye drive circadian and pupillary adjustments through direct projections to the brain. Their action spectrum (lambda(max) approximately 480 nm) implicates an opsin and melanopsin is the only opsin known to exist in these cells. Melanopsin is required for ipRGC photosensitivity and for behavioural photoresponses that survive disrupted rod and cone function. Heterologously expressed melanopsin apparently binds retinaldehyde and mediates photic activation of G proteins. However, its amino-acid sequence differs from vertebrate photosensory opsins and some have suggested that melanopsin may be a photoisomerase, providing retinoid chromophore to an unidentified opsin. To determine whether melanopsin is a functional sensory photopigment, here we transiently expressed it in HEK293 cells that stably expressed TRPC3 channels. Light triggered a membrane depolarization in these cells and increased intracellular calcium. The light response resembled that of ipRGCs, with almost identical spectral sensitivity (lambda(max) approximately 479 nm). The phototransduction pathway included Gq or a related G protein, phospholipase C and TRPC3 channels. We conclude that mammalian melanopsin is a functional sensory photopigment, that it is the photopigment of ganglion-cell photoreceptors, and that these photoreceptors may use an invertebrate-like phototransduction cascade.     

抗人PD-L1单克隆抗体的瞬转表达

利用HEK293 6E细胞瞬转表达抗人PD L1单克隆抗体. 将HEK293 6E细胞无血清悬浮培养, 筛选最佳生长培养基; 考察HEK293 6E细胞的筛选表达培养基、 DNA和PEI质量比及转染时细胞密度等转染条件, 并对收获的抗体进行SDS PAGE和ELISA鉴定. 结果表明: 在A无血清表达培养基中, 以2×106个/mL的细胞密度和m(DNA)∶m(PEI)=1的条件转染, 第4天收获抗体的产量最高, 为170.9 μg/mL; 收获PD-L1抗体的重链分子量约为50 000, 轻链分子量约为25 000.     

PRMT5 suppresses DR4-mediated CCL20 release via NF-κB pathway

Construct expression vectors of pCMV-DR4-HA and pCMV-PRMT5-Flag,and transfect them into HEK293 cells to identify the interaction between TRAIL-R1 and PRMT5 and the molecular mechanism underlying DR4-mediated inhibition of chemokine CCL20 release via TRAIL receptor 1(DR4).Inflammatory cytokine was detected by RT-PCR and ELISA after TRAIL-R1 and/or PRMT5 transfection,respectively.NF-κB activity was detected by Dual Luciferase Reporter Gene Assay.ERK1/2 phosphorylation was analyzed by Western blot.PRMT5 could inhibit DR4-activated NF-κB activity and ERK1/2 phosphorylation.PRMT5 could inhibit NF-κB activition,ERK1/2 phosphorylation as well as CCL20 secretion via binding with DR4 in HEK293 cell,suggesting that PRMT5 may involve in DR4 dependent immune regulation.