一个与鸭繁殖性能相关卵巢差异表达基因的分离分析

本文用mRNA差异表达显示技术,分离分析了繁殖准备期金定鸭(Anas platyrhynchos domesticus)和绿头野鸭(Anas platyrhynchos)卵巢差异表达基因.通过卵巢组织RNA提取、反转录、mRNA差异显示PCR扩增、PAGE和银染检测扩增产物、差异带回收纯化、T载体连接转化和克隆测序分析,获得一个可能与鸭繁殖性能有关的卵巢差异表达基因片段,片段大小882bp.同源性分析表明,其序列与发情期羊卵巢cDNA(同源性为96%)、褐家鼠睾丸cDNA(同源性为83%)有很高的同源性.基因家族摸体分析表明,该序列的部分片段分别与Sox-5基因、转录因子USF基因、性别决定因子SRY、Cdx A基因都有90%以上的同源性典型摸体.由上述分析,我们推测该cDNA片段与鸭繁殖性状有关.     

花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731(感病系)和C712(抗病系)作为材料,利用cDNA-AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况.获得了两个阳性克隆M2和M6.Nprthern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同.而M6是差异表达的cDNA片段.Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列.随后的序列分析发现M6 cDNA片段与拟南芥1号染色体的BAC F19P19中66 665～66 813 bp有84%同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列.推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91%同源性.用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现:M6 cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24 h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势.根据序列分析和初步的功能分析的结果推测:M6 cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段.是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段.     

花椰菜（Brassica oleracea vat．botrytis）抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731（感病系）和C712（抗病系）作为材料,利用cDNA—AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况．获得了两个阳性克隆M2和M6．Northern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同．而M6是差异表达的cDNA片段．Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列．随后的序列分析发现M6cDNA片段与拟南芥1号染色体的BACF19P19中66665～66813bp有84％同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列．推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91％同源性．用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现：M6cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势．根据序列分析和初步的功能分析的结果推测：M6cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段．是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段．     

用mRNA差异显示技术分离盐胁迫下小麦耐盐相关cDNA

目的用mRNA差异显示技术分离小麦盐胁迫应答cDNA,为进一步研究小麦耐盐机理奠定基础。方法将小麦(Triticum aesticum L.)耐盐品系宝丰7228r种子分别置于含NaC l 0‰和12‰的Hoagland培养液中生长,7d后分别取叶片,提取总RNA并分离出其中的mRNA,通过锚锭引物O ligo dT10GC反转录和9个10核苷酸随机引物进行PCR扩增。结果DDRT-PCR结果显示,有4个差异DNA片段只在盐胁迫的小麦耐盐品系基因组中表达,而在对照中没有出现。这4个差异cDNA片段分别命名为ts01(260 bp),ts02(330 bp),ts03(420 bp),ts04(600 bp)。4个差异cD-NA片段的RNA杂交结果显示,只有ts04存在明显差异,在盐胁迫条件下有杂交斑点而在对照中没有杂交斑点,其余3个cDNA片段在盐胁迫和对照中都没有杂交斑点。进一步将ts04克隆并进行DNA序列测定及同源性分析。结论ts04可能是耐盐相关cDNA片段,该片段核酸序列与麦属抗性相关的肌动蛋白基因有23%同源。     

mRNA差异显示法筛选和克隆东亚飞蝗抗药性相关基因

筛选和克隆东亚飞蝗抗药性相关基因.采用mRNA差异显示法(mRNA diffFerential display PCR,DD-PCR),对比了东亚飞蝗在受到氯氰菊酯杀虫剂的诱导前后,基因表达发生的变化.对差异片段进行了回收,克隆、测序,Northern点杂交验证以及序列分析和同源性比较.东亚飞蝗在受到氯氰菊酯杀虫剂的诱导前后,存在明显的基因表达差异,发现差异表达条带9条,对9条差异表达条带进行克隆、测序,经序列分析和同源性比较和RNA点杂交验证,表明确认其中1条带与东亚飞蝗的抗药性有关.东亚飞蝗的mRNA差异显示证明,该EST序列可能在抗药的发生发展中具有一定的作用.     

褐飞虱羧酸酯酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱羧酸酯酶基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为396 bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自铜绿蝇、家蝇、沟鼠、黑腹果蝇、线虫和埃及伊蚊的羧酸酯酶的片段存在高度同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,羧酸酯酶基因表达水平明显升高.以上结果表明,羧酸酯酶基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在有毒化学物质解毒及增强褐飞虱对抗性水稻的耐受性方面可能起着重要作用.     

人和鼠脑cDNA文库的建立以及全长cDNA的批量分离

应用λZAP Express cDNA文库构建试剂盒构建了人3个月和8个月胎儿脑及大小鼠脑cD-NA文库.第2链cDNA经Sepharose CL-4B凝胶过滤层析后去除了较小的片段,使大片段cDNA具有较高的克隆效率.所建立的文库具有较长的插入片段.合并不同长度范围的人3个月胎儿脑cDNA片段,分别克隆入文库载体,获得了长片段、中片段、短片段及合并cDNA文库.从分级文库中各随机挑取300个克隆,经载体引物PCR扩增后,测定5'末端序列,一共获得894个表达序列标签(EST)序列.根据同源性比较结果将感兴趣的克隆环化后测定全长cDNA序列,得到了12条新的全长cDNA.这些文库的建立以及新EST,cDNA的分离为文库筛选和获得脑表达的新基因奠定了基础.     

褐飞虱细胞色素P450基因cDNA片段的克隆、测序及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱细胞色素P450基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为237bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自烟草天蛾、棉铃虫、埃及伊蚊、家蝇、黑腹果蝇和线虫的CYP6家族的P450的氨基酸序列存在同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,P450基因的表达水平明显升高.以上结果表明,P450基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在褐飞虱对抗性水稻的耐受性和解毒方面可能起着重要作用.     

用差异显示反转录PCR银染技术研究小鼠前胃癌相关基因

目的:以N-亚硝基-肌氨酸乙酯(NSEE)作为诱变剂建立NIH小鼠前胃癌动物模型,研究小鼠前胃癌差异表达基因,探索细胞癌变的分子机理.方法:采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)、反向Northern点杂交、克隆、测序和生物信息学分析等方法,对其癌变组织中差异表达的基因进行系统的研究分析.结果:得到5条在小鼠前胃正常对照组织、癌变组织之间差异表达的cDNA片段.筛选后,对其中3个差异条带进行DNA序列测定,有1个与已知基因Tpt1高度同源,2个与同1基因片段AK085193.1高度同源.提示这2个基因与小鼠前胃癌的形成有关.     

棉铃虫滞育解除的相关基因鉴定

运用差异显示PCR(DD-PCR)方法分析棉铃虫滞育解除蛹差异表达的基因,结果得到了56个差异片段.通过RT-PCR和Real-time PCR的方法,鉴定了滞育解除过程中有3个基因表达量在下调,有4个基因表达量在上调.这7个差异表达基因中有3个和已知的基因有较高的同源性:FKBP12,esr16和NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex subunit 6.这些差异基因为今后研究滞育解除的分子机制提供了新的线索.     

Structure of a family of rat amylase genes

The sequences of two cloned rat pancreatic amylase cDNAs comprising 95% of the mRNA sequence are reported. Analysis of cloned rat genomic DNA fragments using cloned cDNA probes indicates that the rat genome contains multiple closely related amylase genes in which the cDNA sequences are distributed within a region 9 kilobases in length and are interrupted by at least seven intervening sequences.     

Isolation of cDNA fragment of fertility-related gene in photoperiod-sensitive genic male sterile rice

The photoperiod_sensitive genic male sterile rice (PGMR) is particularly useful to take advantage of heterosis in rice. mRNA differential display was used to isolate the fertility_relative genes in rice. After establishing an optimized mRNA differential display system, one of the differential cDNA fragments that maybe related to the development and maturation of rice panicle was cloned from a PGMR Nongken 58S.     

差异展示法鉴定GA3诱导的水稻差异表达的mRNA

赤霉素是植物生长发育过程中一类重要的调节激素，在水稻不育系上喷施合适浓度的ＧＡ３（赤霉素的一种）可以克服其包颈现象。运用反转录和聚合酶链式反应建立了一套旨在分离差异表达ｃＤＮＡ的差异展示方法。     

Identification of antiviral- relevant genes in the cultured fish cells induced by UV-inactivated virus

~~Identification of antiviral- relevant genes in the cultured fish cells induced by UV-inactivated virus~~     

Identification of antiviral-relevant genes in the cultured fish cells induced by UV-inactivated virus

UV-inactivated grass carp hemorrhage virus (GCHV) can induce high titer of interferon in cultured CAB (Crucian carp (Carassius auratus L.) blastulae )cells,and thus defend host cells against the virus invasion ,The mechanism is proposed that an antiviral state should be established in the host cells by activating expression of a set of antiviral-relevant genes,In this study ,suppressive subtractive hybridization is applied to constructing a subtracted ,cDNA library with mRNAs isolated from UV-inactivated GCHV infected and mock-infected CAB cells,272 differential cDNA fragments are identified by both PCR and dot blot from the subtractive cDNA library .Sequencing analysis reveals 69 genes,including 46 known gene homlologues,and 23 unknown putative genes,The known genes include the gemes involved in interferon signaling pathways,such as Stat1 and Jak1,the antiviral gences,such as Mx and Vipering,and a set of interferon-stimulated genes observed in mammalian cells. Most of the unknow putative genes contain AU-rich element in their sequences,Differential expressions of these genes are further confirmed by virtual Northern blot and RT-PCR,The data imply that UV-inactivated GCHV is not only able to induce production of interferon in the infected CAB cells,but also leads to the expression of a series of antiviral-relevant genes or immune-releveant genes,and therefore reveals that the signaling pathway of interferon system and antiviral mechanism in fish are similar to those in mammals.     

Linux平台下EST序列分析系统的构建应用实例

利用抑制削减杂交和基因芯片技术获得一批黄孢原毛平革菌特异表达的SET序列，使用Phrap、EMBOSS、B1ast、GENSCAN、MZEF软件，基于Linux操作系统，构建EST序列分析系统，完成了从EST和基因组Blast数据库的构建，载体序列的去除，EST序列的分类和组装，EST序列在基因组上的定位，外显子和内含子的识别以及基因预测，并通过使用perl语言结合bioperl模块写的脚本程序使分析过程自动化，从而可以快速地对大批EST序列进行分析，为克隆相关基因及研究黄孢原毛平革菌功能基因组学提供有用的信息。     

用于Roche/454高通量测序的12个多重标签转录组文库的构建

利用第二代测序技术测定海洋生物转录组已成为揭示海洋生物分子生物学机制的重要工具.以长度为10 nt的不同多重标签(multiplex identifier)进行区分,构建了 杂色鲍(Haliotis diversicolor)、僧帽牡蛎(Saccostrea cucullata)和亚心形扁藻(Platymonas subcordi ormis)3种海洋生物的12个多重标签转录组文库.以合适的比例对各文库进行混合,利用定量PCR、Qubit和NanoDrop-1000等3种DNA浓度测定方法测定每个多重标签转录组文库的DNA浓度,3种方法的数值均一化并加权平均后,按照预定比例混合.为评估文库质量,先采用传统的Sanger测序测定了混合文库的192条序列,发现191条序列具有符合Roche/454高通量测序要求的AB格式,即一端为454A序列,另一端为454B序列;其中189条序列能分辨出其带有的多重标签;插入的平均长度为348 bp.然后通过Roche/454的滴定测序获得了34642条序列,其中32872条序列(94.9％)能分辨出其带有的多重标签,能够精确地分配到12个转录组,并且利用滴定测序结果计算出每个转录组文库的真实比例,对定量PCR、Qubit和NanoDrop-1000进行了评估,结果表明定量PCR是相对准确的定量方法.以上的评估表明所建立的转录组文库构建方法是稳定可靠的,可以广泛应用于转录组学研究.