抗人PD-L1单克隆抗体的瞬转表达

利用HEK293 6E细胞瞬转表达抗人PD L1单克隆抗体. 将HEK293 6E细胞无血清悬浮培养, 筛选最佳生长培养基; 考察HEK293 6E细胞的筛选表达培养基、 DNA和PEI质量比及转染时细胞密度等转染条件, 并对收获的抗体进行SDS PAGE和ELISA鉴定. 结果表明: 在A无血清表达培养基中, 以2×106个/mL的细胞密度和m(DNA)∶m(PEI)=1的条件转染, 第4天收获抗体的产量最高, 为170.9 μg/mL; 收获PD-L1抗体的重链分子量约为50 000, 轻链分子量约为25 000.     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体，并检测其在HEK293细胞中的表达及定位，通过基因重组的方法构建LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体，并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染HEK293细胞，用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。经酶切和基因测序鉴定LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功。转染HEK293细胞后，荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达。说明基因重组技术可成功构建LMP3／pEGFP-N3重组体真核表达载体，重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内。     

脑心肌炎病毒pCMV-HA-VP2表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2,并在HEK293细胞中表达.方法:提取EMCV的总RNA,RT-PCR扩增VP2基因,酶切后构建带HA标签的真核表达质粒pCMV-HA-VP2,运用脂质体介导法将其转染至HEK293细胞中,分别进行过表达检测、Westernblotting分析及IFA检测来验证VP2基因的转录及表达情况.结果:重组表达载体pCMV-HA-VP2构建成功,转染至HEK293细胞中,VP2蛋白和HA标签融合表达成功.结论:EMCV衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2在HEK293细胞中的成功表达,为EMCV衣壳蛋白的功能研究提供理想的实验材料,同时也为EMCV感染机制及其受体研究奠定基础.     

CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用

建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。     

慢病毒介导MCF-7细胞中FOXP2基因沉默体系的建立

为了实现FOXP2基因在MCF-7细胞中稳定低表达,采用基因工程的方法构建pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒干扰载体,并将其与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装shFOXP2干扰慢病毒,收取病毒上清加入到MCF-7细胞中,培养48h,荧光定量PCR检测FOXP2的基因mRNA表达水平,Western Blotting检测FOXP2蛋白表达水平.获得了pMAGic7.1-shFOXP2干扰载体,从而成功建立FOXP2基因稳定干扰的MCF-7细胞株,为进一步研究FOXP2在乳腺癌发生发展中的功能提供了研究材料.     

HEK293 PEAK瞬转快速表达抗体蛋白平台的建立

将HEK293 PEAK细胞用Gibco FreeStyleTM293表达培养液进行无血清悬浮驯化培养,获得无血清悬浮培养的HEK293 PEAK细胞,并经有限稀释法获得细胞亚克隆,建立抗体瞬转表达的工程细胞株.用转染试剂PEI将质粒转入该细胞株中表达抗体.通过优化质粒DNA与转染试剂PEI的比例,质粒与转染试剂的比例为1∶2时,转染效率最佳,并对瞬转表达抗体进行鉴定和活性分析,确认获得具有生物活性的抗体(Herceptin),抗体分子量约150 kD,结果表明已成功建立了以无血清悬浮培养的HEK293 PEAK细胞为宿主细胞的瞬转快速表达抗体蛋白平台.     

双酚类化合物对人胚肾细胞HEK293的毒性和氧化应激的研究

双酚类化合物(bisphenols, BPs)是一类新型环境有机污染物,BPs排放到环境介质后经多种途径进入生物体并在体内蓄积,已逐渐成为威胁环境和健康的重要风险因子。为探明BPs对人体健康的潜在毒性效应,本研究选取人胚肾细胞HEK293作为模型,通过测定细胞活力、胞内活性氧含量、氧化应激参数(SOD、GSH、MDA)及细胞内钙离子水平,比较了BPA、BPS、BPF和BPAF对HEK293细胞的毒性影响。结果表明,BPA、BPS、BPF和BPAF能够不同程度的抑制HEK293细胞活力,通过促进氧化应激产生 ROS,降低抗氧化能力,迅速提高细胞内Ca²⁺水平,诱导HEK293细胞损伤。在本研究所选的浓度范围内,BPAF对HEK293细胞的毒性影响最大,BPA和BPF对HEK293细胞的毒性影响次之,BPS对HEK293细胞的毒性影响较小。本研究为深化了解双酚类化合物的毒理学系统研究和风险评估提供参考依据。     

稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建

为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.     

人源化AGR2单抗在不同宿主细胞中表达的比较

Anterior gradient-2(AGR2)基因是一种与肿瘤生长、转移、浸润及耐药性密切相关的基因,以AGR2为靶点的人源化单克隆抗体rhAGR2-mAb有望成为一种新型的抗肿瘤药物.本研究为了进行该抗体的成药性评价,通过瞬时转染的方法分别用HEK293F细胞与CHO细胞这两种最常用的表达系统表达rhAGR2-mAb,获得了纯度为95%的抗体蛋白,同时比较了不同宿主细胞生产的蛋白在分子量、等电点、糖型等方面的差异,发现在分子量、等电点和糖基化的糖型种类方面,两种宿主细胞表达的rhAGR2-mAb并无明显差异,但两者表达的产物在糖型比例上有较大不同,这也导致了两种表达系统所表达的蛋白与抗原AGR2的亲和力略有不同,为rhAGR2-mAb将来选择合适的蛋白瞬时表达系统和稳定生产系统提供依据.     

Building of hFⅨ transgenic mice by spermatogenic cells

Human FⅨ expression vector pCMVⅨ was packaged by effectene^TM reagent and injected into mice seminiferous tubules with glass pipettes.The expressional frame of pCMVⅨ was examined by PCR and Southern blotting among 41 progenies.There were 2(4%) mice being integrated with hFⅨ gene into chromosomes.4.6ng/mL of hFⅨ protein was expressed in plasma of one mouse,which was tested by ELISA.We demonstrated that building of transgenic animals by spermatogonial stem cells is an efficient method.Meanwhile,it has also been proved to be an alternative choice for mammary gland bioreactor.     

吲哚胺2，3-双加氧酶下调HLA-I类分子的表达

目的：探讨人类吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）对细胞表面HLA-I类分子的影响。方法：用脂质体法将含IDO基因的重组质粒pEGFP-IDO转染293T细胞,用Western blot检测IDOGFP在转染细胞中的表达,荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-I类分子的表达。结果：Western blot证实转染重组质粒的细胞表达IDO。转染空载体的细胞与转染重组质粒的细胞HLA-A,B,C-PE染色的平均荧光强度分别为299.46±62.65及42.51±8.19,两者相比有显著性差异（P〈0.01）;转染重组质粒的细胞,未加色氨酸组与色氨酸组HLA-A,B,C-PE染色的平均荧光强度分别为309.17±34.89及692.12±33.42,两者相比亦有显著性差异（P〈0.01）。结论：IDO下调细胞表面HLA-I类分子的表达,色氨酸能够逆转IDO所致的HLA-I类分子的下调。     

脂质体转染人肝星状细胞和肝细胞条件优化

利用Lipofectamine 2000(Lipo)介导LacZ及EGFP基因转染人肝星状细胞系LX-2和人肝细胞系Chang Liver,探讨Lipo用量、质粒用量、转染时间、细胞初始接种密度及不同启动子驱动对转染效率的影响.结果显示,两种细胞均能得到高效转染,Chang Liver细胞转染效率(80%)高于LX-2细胞(60%).Lipo用量为每孔2μL,转染后6 h换液,LX-2细胞应用质粒DNA为每孔0.45μg,Chang Liver细胞应用质粒DNA为每孔0.30~0.45μg,此时转染效率最高.巨细胞病毒(CMV)启动子驱动LacZ转染效率与CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染效率无显著差异;细胞初始接种密度对转染效率无显著影响.     

增强型绿色荧光蛋白表达对鼠C6细胞生物学特征影响的研究

脂质体包裹质粒pEGFP-N1转染C6细胞,经G418筛选,得到稳定表达绿色荧光的C6-EGFP细胞.细胞计数,MTT,流式细胞术分别测定C6细胞在转染绿色荧光蛋白后增殖性,细胞活力以及细胞周期等生物学特性.C6细胞在转染了绿色荧光蛋白基因后细胞增殖性降低,细胞活力降低,细胞周期也发生了一些改变.     

磷酸钙转染方法的优化

通过比较293T细胞的接种密度、质粒DNA的量以及CO2浓度对磷酸钙转染方法的影响,确定最佳的转染条件.以各单因素试验的最适条件为依据,设计三因素三水平的正交试验.结果表明,磷酸钙介导质粒DNA转染,当293T细胞的接种密度为5×105/mL、质粒DNA的量为30μg、细胞培养环境CO2浓度为3%时,转染效果最佳.     

空间微重力环境对人牙髓间充质细胞的影响初探

通过实际空间搭载实验,研究空间环境对人牙髓间充质细胞的影响。将人牙髓间充质细胞无源(细胞保存于密闭环境条件中,没有细胞培养所需的5%CO2、37℃、饱和湿度标准条件的适宜环境)搭载长征2号飞船进入空间环境,空间飞行时间为17d,返回地面后,继续培养成活并传代,观察其细胞骨架的改变。激光共聚焦显微镜观察显示:空间实验组细胞骨架出现弥散性的变化,局部微丝解聚。实验结果表明:人牙髓间充质细胞经历空间飞行后可以继续成活,并且细胞骨架发生了明显改变。     

Characterization of Adherent Nonhematopoietic Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

To confirm and characterize the adherent fibroblast-like progenitors in human umbilical cord blood,we isolated mononuclear cells from human umbilical cord blood by FicolI-Hypaque. Two main morphologically different kinds of cells were formed by culturing the cells in collagen-coated 24-well plastic dishes and flasks.One type was the adherent fibroblast-like cells, while the other was loosely adherent clonally expanded round cells. Our experiments demonstrate that the adherent fibroblast-like cells possess multilineage potential,including the ability to differentiate into endothelial-like cells and to express the mesenchymal cell marker.     

人正常子宫内膜树突状细胞的周期性变化

目的：研究人正常子宫内膜上树突状细胞(dendritic cell，DC)的分布特点。方法：对10例人正常子宫内膜组织应用HLA-DR单克隆抗体和CD1a蛋白抗体进行免疫组化染色，其中增殖期内膜4例、分泌期内膜3例、绝经期内膜3例，观察其中的阳性细胞。结果：10例正常子宫内膜标本中，5例呈HLA-DR阳性表达(增殖期4例，分泌期1例，绝经期0例)；4例呈CD1a阳性表达(增殖期3例，分泌期1例，绝经期0例)。结论：人正常子宫内膜组织中存在表达主要组织相容性复合体-Ⅱ(MHC-Ⅱ)类分子的DC，各时期的子宫内膜DC检出率不同。     

多孔CPC材料复合转染VEGF的骨髓间充质干细胞修复大鼠颅骨缺损的实验研究

为研究转染血管内皮生长因子(VEGF)基因的骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合多孔CPC构建的组织工程化骨对骨缺损的修复作用,用脂质体介导质粒pIRES2-EGFP/VEGF165转染大鼠BMSCs,与多孔CPC复合体外构建组织工程化骨,植入大鼠颅骨缺损模型,未转染VEGF165的组织工程化骨作对照。分别在4周、12周取材,以组织学组织形态学分析骨缺损修复情况.比较两组的骨形成差异。结果转染VEGF组骨缺损的修复效果明显好于未转染组。组织形态计量学分析显示,4周时,转染组材料内新生骨面积为31.9%,未转染组为19.7%。12周时,转染组材料内新生骨面积为75.9%,未转染组仅为49.7%。差异具有统计学意义(P<0.000 1)。转染组的骨形成速率明显快于未转染组,两者分别为分别为6.18±1.62μm/d和3.56±0.93μm/d。说明VEGF转染细胞组较对照组血供加强,骨缺损修复加速。     

基因导入技术及其应用

电融合和电导入技术是八十年代发展起来的一种新的生物技术。其转换率是用化学方法所得不到的。LN-101基因脉冲导入仪能提供2500伏脉冲电压和160安培电流。无论在高阻的和低阻的介质中(如盐和蔗糖缓冲剂)均能使用该仪器。