木聚糖酶降解蔗渣木聚糖最优条件研究

蔗渣木聚糖酶解过程中,木聚糖酶添加量、酶解pH、温度、时间及因素间交互作用均对低聚木糖得率产生不同程度的影响。采用响应曲面设计方法,通过分析优化所选指标与低聚木糖得率间函数关系模型,得到最优酶解工艺参数为酶添加量3.68%、酶解pH5.33、时间6 h、温度47.31℃。理论低聚木糖得率85.32%,平均聚合度2.24。在酶添加量3.7%、酶解pH5.3、时间6 h、温度47℃实际验证下,低聚木糖得率为82.04%,略低于理论数值,平均聚合度2.28。     

调控酶解底物初始pH制备低聚木糖

研究在木聚糖酶定向酶解纯木聚糖及木聚糖碱抽提液制备功能性低聚木糖时,酸和缓冲溶液调控底物的初始ｐＨ对低聚木糖的影响。结果表明,木聚糖酶在ｐＨ５．０左右的活力最高;酸调控纯木聚糖底物的低聚木糖得率低于缓冲溶液调控的低聚木糖得率,但两者相关不大;而当底物为木聚糖碱抽提液是,由于木素的存在,两种调控方式的低聚木糖得率相差较大,酶解液出现浑浊状态;酸调控纯木聚糖,木聚糖碱抽提液时,低聚木糖得率最高的初始ｐ     

新型α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶RuAra1的表达与鉴定

随着能源问题的日益突出,半纤维素资源的利用逐渐受到人们的重视.α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Larabinofuranosidase,EC 3.2.1.55)属于半纤维素酶系,能水解以α-1,3、α-1,2或α-1,5键连在木聚糖主链上的阿拉伯糖单体或低聚阿拉伯糖侧支.本实验室将克隆得到的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因RuAral在大肠杆菌中重组表达,得到的重组阿拉伯呋喃糖苷酶RuAral能够水解4-硝基酚-α-L-阿拉伯糖苷(4-Nitrophenyl-α-Larabinofuranoside,pNPA)、4-硝基酚-β-D-吡喃木糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside,pNPX)以及从小麦阿拉伯木聚糖中水解释放阿拉伯单糖.以pNPX为底物时,该酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为50℃.RuAral与瘤胃真菌(Neocallimastix patriciarum)内切木聚糖酶XynCIDBFV、瘤胃细菌木糖苷酶RuXynl的组合使用可以实现对小麦阿拉伯木聚糖的协同降解,且降解效率优于德国AB酶制剂公司的商品酶ROHALASE WP.     

系列木聚糖降解酶基因同向串连表达的研究

采用分子克隆操作方法，通过设计多个SD序列的多克隆位点，首次成功构建了一个木聚糖降解酶系列基因同向串连表达载体，经筛选鉴定获得具有极耐热性的α-阿拉伯呋喃糖苷酶基因（XarB）、葡萄糖醛酸酶基冈（αguA）和木聚精酶基因（龄nB）同向串连的pHsh／XarB-aguA-XynB一株克隆菌，酶学分析表明重组菌株具有较好的阿拉伯糖苷酶、木糖苷酶、葡萄糖醛酸酶和木聚糖酶活性．酶活单位分别为：阿拉伯糖苷酶11．8U／mL，β-木糖苷酶6．87U／mL，α-葡萄糖醛酸酶1．53U／mL，木聚糖酶6．58U／mL．     

酶法制备低聚木糖的研究

利用木聚糖酶酶解小麦麸皮制备低聚木糖,为麸皮的深加工开辟了一条新途径.根据实验确定了木聚糖酶水解麸皮木聚糖的工艺条件,即酶浓度为1200 IU/g底物,木聚糖终质量分数为12%,水解温度为40℃,水解时间为6 h,总糖得率为57.12%,低聚木糖的得率为22.52%.对酶解液进行定性定量分析,结果表明,其主要成分为木二糖和木三糖.     

木聚糖酶分级对高温降解木聚糖酶水解的影响

为提高酶解液中聚合度为2～5的低聚木糖含量,采用超滤的方法对木聚糖酶进行分级,用于高温降解木聚糖的酶水解。结果表明：木聚糖酶原酶液经超滤分级后,得到的木聚糖酶A组分（分子质量为30～50 ku）、B组分（分子质量为10～30 ku）和C组分（分子质量小于10 ku）,均能使木聚糖中聚合度较高的糖降解为聚合度为2～5的低聚木糖。木聚糖酶B组分由于富含内切木聚糖酶XYN I和XYNⅡ,1 mg酶蛋白可以产生263 g木二糖、185 g木三糖、115g木四糖和046 g木五糖,明显高于木聚糖酶A和C组分高温降解木聚糖的水解能力。     

一株具木聚糖酶活链霉菌的鉴定及其木聚糖降解酶系分析

分离得到一株具木聚糖酶活性的放线菌菌株pp2，该菌株具有典型链霉菌属的形态学特征．通过对其进行形态学、生理生化特性以及16S rRNA基因序列等方面的分类学研究。菌株pp2初步鉴定为链霉菌属的一个潜在新种，通过对菌株pp2的酶系研究发现该菌株胞外发酵液具木聚糖酶活性，细胞破碎液中具α-L-阿拉伯糖苷酶活性和β-D-本糖苷酶活性．其中木聚糖酶酶活力为30．3U／mg，酶反应最适温度为65℃，最适pH为5．4；37℃下稳定性很好，60℃下酶活性衰减很快、α-L-阿拉伯糖苷酶酶活力为1．81U／mg。酶反应最适温度为55℃，最适pH为6．0，55℃下稳定性能很好．β-D-木糖苷酶酶活力为0．04U／mg．     

木聚糖降解酶酶法制取低聚木糖的初步研究

木聚糖酶是一类复合酶系,木聚糖水解酶具有多重性现象.酶解法的关键在于木聚糖酶对底物的适应性,即选择合适的木聚糖酶.着重介绍木聚糖的预处理、选择相关条件酶解.正交试验表明,木聚糖酶水解木聚糖的条件为:在摇床转速为220r/min,温度为45℃的条件下,50mL缓冲液(pH=3.6)中加入0.02%木聚糖酶酶解2g粗木聚糖5h,得到低聚木糖浓度为4.12mg/mL,低聚木糖占总糖浓度的41.18%.     

里氏木霉木聚糖酶的分离纯化及其性质

使用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-25凝胶色谱脱盐、DEAE-Sephadex A-50和SP-SephadexC-50离子交换色谱等分离纯化技术，从里氏木霉（Trichoderma reesei）RutC-30培养液中分离出木聚糖酶组分，再经SephadexG-100凝胶过滤色谱进一步分离纯化，得到2个纯木聚糖酶组分A组和组分B。经SDS-PAGE鉴定两组分为单带，相对分子质量分别为20300和13500。组分A的最适反应条件为45℃、pH3.0-5.5很稳定，酶解产物主要是低聚木糖，只含少量木糖；组分B的最适反应条件为55℃、pH5.5，酶解产物全部是低聚木糖。     

不同反应器条件下纸浆蔗渣的酶法水解反应过程研究

以蒸煮时间为5.5h、温度155－160℃、P＝0．6MPa、pH4．5的纸浆蔗渣为底物，采用Yakult Onozuka R-10的纤维素酶，在50℃、pH5．0的条件下，考察了釜式和固定床反应器对蔗渣法水解的影响，测定了在不同底物浓度、不同搅拌强度和不同循环流速下还原糖的得率。结果表明，对釜式反应器来说，底物浓度高则转化率低，搅拌强度加大对纤维素水解有利；对固定床反应器而言，循环流速增加，可提高蔗渣的酶解还原糖得率。从工业化的过程来说 ，采用固定床反应器蔗渣酶解反应釜式反应器有利。     

嗜碱芽孢杆菌耐热耐碱内切木聚糖酶基因的密码子优化及在毕赤酵母中的表达

【目的】研究极端耐热耐碱的木聚糖酶,使其能够满足造纸行业中碱性高温的苛刻环境。【方法】将一种来源于嗜碱芽孢杆菌S7的耐热耐碱内切木聚糖酶基因(xyn10A)密码子进行优化,基因合成后克隆至pHBM905BDM载体上,并转化毕赤酵母GS115菌株。【结果】木聚糖酶基因(xyn10A)优化后与原始序列比对相似性为76.70%。基因合成后克隆到pHBM905BDM载体上,并成功转化毕赤酵母GS115菌株。通过交联木聚糖底物平板水解圈法初筛及摇瓶复筛得到一株产酶量较高的菌株,且其在摇瓶发酵第10天达到最高酶活力,为495U/mL。另外,糖基化分析表明该酶在毕赤酵母中表达时被糖基化修饰。【结论】密码子优化后的极端耐热耐碱木聚糖酶基因在毕赤酵母中成功表达。     

方格星虫多糖碱法提取工艺研究

【目的】研究碱法提取方格星虫体壁中水溶性方格星虫多糖的条件及优化。【方法】根据料液比、浸提时间、浸提温度、碱液浓度对多糖得率的影响,并通过正交试验得到方格星虫水溶性多糖浸提工艺优选因素组合。【结果】影响方格星虫多糖得率的因素主次顺序为浸提温度料液比浸提时间碱液浓度;最佳浸提条件为温度50℃,料液比1∶6g/mL,时间4h,碱液(NaOH)的质量分数为8%。【结论】最佳浸提工艺条件下多糖浸提提取率最大为1.81%。     

酶法提取方格星虫多糖的条件及优化

【目的】确定胰蛋白酶酶解法提取方格星虫(Sipunculus nudus)体壁中水溶性多糖的最优条件。【方法】分别从料液比、浸提温度、浸提时间、浸提pH值、酶底比等5个方面进行了初步研究。研究分为两部分进行,先确认提取方法中各单因素的最优条件,再根据单因素试验结果选取4个主要因素(料液比、浸提温度、浸提pH值、酶底比),进行四因素三水平的正交试验,得到方格星虫水溶性多糖水提法的最佳组合。【结果】正交试验结果表明:对方格星虫多糖提取率影响最大的为浸提温度,其次是pH值和料液比,影响最小的为酶底比。最佳浸提条件为:温度60℃、pH值8.0、料液比1∶12g·mL-1、酶底比为2.0%、时间3h。【结论】在最优浸提条件下,方格星虫水溶性多糖酶提法所得的最佳提取率为1.59%。此方法高效稳定可行,能有效提高方格星虫的多糖提取率。     

里氏木霉和黑曲霉产酸性木聚糖酶及酶学特性比较

【目的】对黑曲霉和里氏木霉产酸性木聚糖酶的性能及所产粗酶的酶学特性进行分析比较,尤其是考察pH值为4时木聚糖酶酶活力及稳定性,从而确定潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。【方法】将里氏木霉和黑曲霉接种至培养基进行产酶培养,比较分析两者的酸性木聚糖酶、酸性木糖苷酶的酶活力及酶学特性。【结果】黑曲霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(52.36±2.61)U/mL和(0.57±0.01)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为55℃、5.0,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为75℃、5.0;里氏木霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(10.12±0.95)U/mL和(0.32±0.05)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为65℃、6.5,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为65℃、4.5。黑曲霉和里氏木霉的酸性木聚糖酶兼有酸性CMCase酶活力,分别为(5.26±0.21)U/mL、(1.72±0.21)U/mL。【结论】黑曲霉所产酸性木聚糖酶明显比里氏木霉的更优良,是潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。     

纤维微菌XM-8木聚糖酶基因克隆及酶学性质

【目的】为获得可应用于木聚糖水解的酶资源,希望通过筛选分离得到能够水解木聚糖的木聚糖酶产生菌,克隆表达木聚糖酶基因并研究其酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解木聚糖的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定。扩增其木聚糖酶基因,以pET22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为纤维微菌。通过PCR成功克隆到该菌的木聚糖酶基因(xyn-8a),并构建共表达质粒pET22b-xyn-8a,实现木聚糖酶Xyn-8a的活性表达。酶学性质研究表明Xyn-8a最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,只对木聚糖底物有活性;HPLC分析其水解产物以木二糖为主,还有少量的木糖和木三糖。【结论】XYN-8A在pH值为6的条件下具有较高活力,且可以催化水解反应,在生产低聚木糖方面具有一定的应用价值。     

响应面法优化狭鳕鱼鱼皮酸溶性胶原蛋白质的提取工艺

【目的】优化狭鳕鱼(Theragra chalcogramma)鱼皮中酸溶性胶原蛋白质的提取工艺,为实际生产提供工艺数据和理论依据。【方法】在乙酸浓度、提取时间和料液比的单因素实验基础上,以酸溶性胶原蛋白质提取率为响应值,采用Box-Behnken设计实验,建立提取率的二次多项式回归模型,考察3个因素对提取率的影响。【结果】对酸溶性胶原蛋白质提取率的影响为料液比提取时间乙酸浓度;交互项中"料液比-提取时间"项对提取率影响极其显著,"料液比-乙酸浓度"项对提取率影响显著,其他交互项对提取率影响不显著;通过实验数据结合回归模型进行数学分析,得到提取狭鳕鱼鱼皮酸溶性胶原蛋白质的最佳工艺参数:乙酸浓度0.5mol/L、提取时间40min、料液比1∶9。在优化参数条件下,酸溶性胶原蛋白质提取率的理论预测值为20.53%,实测值为20.10%;试验提取得到的胶原蛋白电泳图谱较为清晰,无杂条带出现。【结论】该回归模型合理可行,提取的产物基本保持了胶原蛋白质的原有结构。     

青春双歧杆菌体外代谢低聚木糖的研究

研究了以酶法制备和以高温降解制备的低聚木糖体外对青春双歧杆菌的增殖作用以及双歧杆菌代谢低聚木糖的规律。结果表明:以酶法制备的3 g/L低聚木糖为碳源时,菌体浓度在18 h达到最大值0.43 g/L,增殖了3.73倍;以高温降解的3 g/L低聚木糖为碳源时,菌体的浓度24 h时达到最大值0.19 g/L,增殖1.16倍。酶法制备低聚木糖增殖效果优于高温降解低聚木糖。在代谢过程中发现青春双歧杆菌优先利用木二、木三糖,在利用聚合度3以上的低聚木糖的同时会释放出阿拉伯糖和木糖。青春双歧杆菌对木二、木三、木四、木五和木六糖利用率分别为94.00%、50.00%、83.87%、60.87%和48.28%,其代谢产物主要是乳酸、乙酸和丙酸。     

热提羊栖菜多糖对黑腹果蝇生长的影响

【目的】研究经热提醇沉得到的羊栖菜多糖(SFPs)对黑腹果蝇生长的影响。【方法】采用85℃热水煮提,乙醇沉淀,氯化钙去除褐藻淀粉等多种工序提取羊栖菜多糖,并分析其化学性质;以黑腹果蝇为实验对象,研究羊栖菜多糖浓度对黑腹果蝇幼虫体型、体重和羽化的影响。【结果】经热提醇沉得到的羊栖菜多糖纯度较高,总糖含量高达81.93%,分子量和单糖组成较稳定。与对照组相比,经羊栖菜多糖处理后,黑腹果蝇在体型和体重上均有增加。实验组0.1%♀和1.5%♀与对照组CK♀存在显著差异(P0.05),0.5%♀组与对照组CK♀存在极显著差异(P0.01);实验组0.1%♂、0.5%♂、1.5%♂与对照组CK♂存在显著差异,但实验组之间并没有显著差异,其中1.5%♂组增重最为明显。实验组与对照组在幼虫孵化率上存在显著差异;对照组黑腹果蝇从卵至羽化为5~8d,0.1%和0.5%组为6~9d,1.5%组为6~10d。0.1%♀、1.5%♀、0.1%♂组与相对应的对照组相比,羽化数量存在显著差异;对比羽化成虫雌雄比例,只有1.5%组与CK组存在显著差异。【结论】经热提醇沉法提取的羊栖菜多糖性质稳定,能降低黑腹果蝇幼虫羽化率,延长幼虫羽化时间,对果蝇后代的雌雄比例略有影响,同时可以增大成虫体型,增加成虫体重。     

玉米芯中木聚糖提取方法的研究

采用碱解玉米芯粉末后,玉米芯碱解液用30%(w:v)过氧化氢溶液脱色并且用10%(w:v)三氯乙酸溶液脱蛋白来提取木聚糖,收得率分别为24.4%。并用真菌DSM10635菌株产的木聚糖酶对以三种不同来源的木聚糖以及自提玉米芯木聚糖为底物测得的米氏常数进行比较,还检测比较了DSM 10635木聚糖酶以桦树和自提木聚糖作为底物的最佳酶促反应温度。结果表明,从玉米芯自提木聚糖的Km值7.5303与燕麦木聚糖的Km值5.6044相近,桦树和自提的木聚糖的最佳酶促反应温度也都在65-70℃左右,具有一定的取代性。方法简单,收得率较高的木聚糖提取方法对工业上大量生产具有重要的意义。     

芽孢杆菌组合对海水养殖水体COD的降解效果

【目的】获得一种降解性能优于单菌株的菌株组合,更好地改善目前工业化密度养殖的水体水质。【方法】从刺参(Stichopus japonicus)养殖池塘分离降解效果良好的单菌株,根据菌株之间的拮抗效应,按照2株菌或3株菌进行组合,研究各组合菌株的降解效果。【结果】2株菌的组合第6天时COD含量的均值为422.57mg/L,标准差为63.85,3株菌的组合第6天时COD含量的均值为365.61mg/L,标准差为67.63,说明3株菌的组合整体降解效果比2株菌的组合好,且更容易获得降解效率高的组合,但并不是所有3株菌的组合降解效果都优于2株菌的组合。【结论】确定最优菌株组合为C14(菌株B2,菌株B6,菌株B11),COD降解率为64.29%。经鉴定,菌株B2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),菌株B6为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),菌株B11为嗜碱性芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus),为今后的实践应用提供参考。