兔抗Ｍ１３噬菌体酶标抗体的制备

M13噬菌体已被广泛地应用于噬菌体展示技术.M13的酶标抗体,是在噬菌体展示技术筛选结果ELISA检测中不可缺少的试剂.我们制备了兔抗M13抗血清,其效价高于1:6000;经两步饱和硫酸铵沉淀,初步纯化了兔抗M13抗体;用过碘酸钠法对抗体进行了辣根过氧化酶的标记,酶标记抗体活性为1:6400.     

比较免疫磁珠法与A蛋白亲和层析法纯化兔抗血清中的IgG

优化了免疫磁珠分离法纯化抗血清的实验条件,并与A蛋白亲和层析法比较纯化效果,以求得到一种简便、快速、高效的纯化IgG方法.结果表明:从5只新西兰兔获得210 mL试管凝集效价高达1∶5 120的兔抗鳗弧菌抗血清,磁珠与IgG结合10 min达到平衡,其最大结合量为0.227 mg/mL;免疫磁珠分离法与A蛋白亲和层析法...     

兔抗SARS冠状病毒IgG的纯化及鉴定

目的：制备高纯度的兔抗SARS冠状病毒的IgG。方法：采用辛酸-硫酸铵沉淀进行初纯,以及DEAE离子交换层析精纯IgG,利用SDS-PAGE对纯化后的IgG纯度进行测定,利用间接ELISA、病毒中和滴定对IgG进行效价测定。结果：纯化后的IgG相对纯度达到90％以上,ELISA检测效价为1：4800,病毒中和效价为1：640。结论：利用上述纯化工艺能获得高纯度的兔抗SAILS冠状病毒IgG,同时抗体活性损失较小。     

ELISA法快速测定McAb培养上清中鼠源IgG质量浓度

用小鼠IgG纯品免疫新西兰大白兔,获得兔抗小鼠IgG多克隆抗体.以兔抗小鼠lgG多抗包被聚苯乙烯微孔板.配以辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体和以3,3'5,5-四甲基联苯胺(TMB)为底物,建立了快速测定McAb培养上清中鼠源IgG的双抗体夹心ELISA方法.该方法的检测线性范围是7.02ng/mL至449.38ng/mL之间,回收率在94.83%-115.15%之间,变异系数在1.45%-9.94%之间.显然用该方法测定MeAb培养上清中鼠源IgG质量浓度是可行的.     

八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRF1a多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

将八肋游仆虫第一类肽链释放因子基因eRF1a克隆入表达载体pRSETc,并在大肠杆菌Bl21(DE3)中进行诱导表达.表达形成的包含体经切胶回收,然后免疫大鼠制备抗血清.所获得的抗血清用Amersham Biosciences抗体纯化试剂盒进行纯化,SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的抗体纯度很高.Western blotting印迹和ELISA鉴定结果表明抗体特异性好,效价为1∶5000.     

八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRFla多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

将八肋游仆虫第一类肽链释放因子基因eRFla克隆入表达载体pRSETc,并在大肠杆茵B121(DE3)中进行诱导表达.表达形成的包含体经切胶回收,然后免疫大鼠制备抗血清.所获得的抗血清用Amersham Biosciences抗体纯化试剂盒进行纯化,SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的抗体纯度很高.Western blotting印迹和ELISA鉴定结果表明抗体特异性好,效价为1 5 000.     

肾综合征出血热病毒单克隆抗体7C11的纯化与鉴定

为获得高纯度的抗肾综合征出血热病毒单克隆抗体,建立杂交瘤细胞株7C11两步纯化的方法并进行亚类及特异性鉴定。采用Balb/c小鼠制备7C11单克隆抗体腹水,辛酸-硫酸铵法初步分离纯化,蛋白G亲和层析柱进一步分离纯化并鉴定。经初步分离纯化后,单抗IgG纯度>80%,回收率>50%;经过Protein G层析柱二次分离纯化后,单抗IgG纯度>98%,回收率>50%。亚类鉴定为IgG1,且特异性较好。成功获得高纯度的抗HFRS单克隆抗体,为抗汉坦型肾综合征出血热抗原表位的鉴定、抗原物质结构与功能的关系等后续研究奠定基础。     

重组猪生长激素抗体的制备与纯化

为了获得重组猪生长激素抗体,对重组猪生长激素融合基因的真核表达产物进行免疫印迹(Western blot)检测,将利用DNA重组技术构建的重组质粒pPGH020在大肠杆菌(E.coli)BL21中进行诱导表达.表达产物经Ni+亲和层析柱纯化,获得纯化的重组猪生长激素融合蛋白.然后以此为抗原免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗体,抗体再经硫铵沉淀、透析和亲和层析纯化.Western印迹结果表明,该纯化抗体显示了良好的免疫反应,其灵敏度比兔抗rpGH抗血清提高50倍,为猪生长激素融合基因在真核细胞的表达及功能鉴定奠定了基础.     

兔抗人多发性骨髓瘤细胞多克隆抗体的制备与鉴定

制备人多发性骨髓瘤全细胞兔多克隆抗体。用人多发性骨髓瘤细胞系ARH-77全细胞和福氏完全佐剂通过背部皮内多点注射首次免疫新西兰大白兔,第14 d用ARH-77全细胞和福氏不完全佐剂同样剂量加强免疫,第28 d和38 d时再次免疫。第45 d颈动脉采血80 mL,4℃静置过夜,收集血清。然后采用亲和层析系统纯化血清中的多克隆抗体。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测纯化多克隆抗体的效价;免疫印迹法和荧光免疫细胞化学检测纯化多克隆抗体的特异性。结果:ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶20 000,免疫印迹检测结果显示该抗体具有较高特异性,荧光免疫细胞化学检测多克隆抗体能够有效的结合细胞表面抗原。实验获得了高效价的特异性的兔抗人骨髓瘤细胞多克隆抗体,为进一步研究多发性骨髓瘤诊断和治疗奠定了基础。     

HRP标记β_2-微球蛋白单克隆抗体的研究

用辣根过氧化物酶(HRP)标记β2-微球蛋白单克隆抗体,以此作为ELISA实验的酶标二抗.用过碘酸钠将辣根过氧化物酶(HRP)的糖的部分轻微氧化为醛基,然后与抗体氨基进行反应,形成辣根过氧化酶(HRP)与抗体的结合物.将β2-微球蛋白与过氧化物酶的结合物进行纯化,得到较纯的酶结合物,以此作为ELISA的酶标二抗.     

抗猪促卵泡激素小鼠源单克隆抗体的研究

用猪促卵泡激素(PESH)作为抗原免疫BALB/C小鼠。通过将免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠骨髓瘤细胞(SP2/O—Ag14)进行融合,建立了九株能稳定分泌抗PFSH单克隆抗体的杂交瘤细胞。其中三株杂交瘤细胞分泌的抗体被证实是对PFSH特异结合的,它们和另一种非常相近的垂体激素——猪促黄体激素(PLH)不结合。用有限稀释法对全部九株杂交瘤进行了三次亚克隆。有几种单克隆抗体被羟基磷灰石柱层析一步法从小鼠腹水所纯化。以聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测经纯化单克隆抗体制品的纯度。     

拟穴青蟹新型过敏原磷酸丙糖异构酶的鉴定分析

利用硫酸铵盐析和柱层析对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)进行处理,纯化得到28 ku的新型过敏原蛋白,经质谱鉴定为磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase,TIM）,与中华绒螯（Eriocheir sinensis）TIM序列相似度达到93%。该过敏原蛋白能够与甲壳类过敏患者血清和兔抗克氏原螯虾多克隆抗体发生特异性反应,等电点为5.8。对热处理稳定,加热温度高于50 ℃时发生聚合,且多聚体仍具有免疫结合活性,pH＞9.0时,对TIM免疫结合活性略有影响。在模拟胃肠液消化过程中,TIM耐受胰蛋白酶消化但不耐受胃蛋白酶消化,模拟胃液消化后的小分子片段仍保留有IgG结合活性。综合血清学及性质分析,该磷酸丙糖异构酶是拟穴青蟹的一种新型过敏原。     

正己酸-低温乙醇沉淀法纯化小鼠腹水IgM类单抗的研究

用不同有机酸-低温乙醇纯化腹水,确定纯化效果最好的有机酸为正己酸,纯化的IgM纯度可达95％,收率将近90％;用正己酸沉庭法配合低温乙醇沉淀法分别纯化不同抗原免疫的三种IgM型单抗,对多数IgM类抗体纯度可达到85％以上,IgM回收卒大于85％,表明这种纯化方法适用于多数IgM类单抗的纯化;用硫酸铵沉淀法及正己酸-低温乙醇沉淀法纯化相同的抗体,对活性都不影响,但正己酸-低温乙醇沉淀法纯化的抗体纯度远高于硫酸铵沉淀法、因此正己酸-低温乙醇沉淀法是一种简单、快速、温和的从小鼠腹水中纯化IgM方法,可满足一般实验的要求、     

烟草花叶病毒单克隆抗体的制备和鉴定

经工程菌表达与纯化,得到了纯度95%以上的TMV-CP-F重组蛋白,配合提取的TMV天然病毒颗粒作为免疫原.通过杂交瘤技术获得了14株能分泌特异针对TMV外壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株.经鉴定14株细胞所分泌的抗体亚类为IgG1型,抗体轻链均为κ型.经ProteinA一步法亲和层析纯化所得抗体经鉴定相对分子质量在149.36～157.23 ku之间,抗体纯度在80%以上.经间接ELISA测定,14株抗体均与TMV-CP重组蛋白和TMV病毒有良好特异性反应.所制备的抗TMV抗体的特异性高,可用于与其相关的免疫检测研究和应用.     

人白血病抑制因子（hLIF）单克隆抗体的制备与鉴定

 为了获得抗人白血病抑制因子（hLIF）单克隆抗体,以重组hLIF蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的小细胞融合、无限稀释法制备了10株杂交瘤的腹水hLIF抗体,并对腹水进行了纯化.腹水粗品抗体经rProteinA一步亲和层析法纯化和鉴定后,抗体分子量都符合抗体的特性,抗体的纯度都达到了96.6%以上,抗体亲和常数在1.89×10-9~1.51×10-12mol/L,其中1B8a、5C1b、5G4a细胞株制备的抗体属于高亲和力抗体,可以对其的应用进行进一步的研究和探讨.     

应用酶联免疫吸附试验检测山羊日本血吸虫病抗体的研究

本研究首先制备了日本血吸虫水溶性止卵抗原和兔抗山羊酶标复合物。经测试确定了:抗原的最适包被浓度(5ug/ml);酶标复合物的最佳工作浓度(1:2500)以及血清不同稀释度下的阴—阳临界值,从而成功地建立了山羊日本血吸虫病抗体的酶联免疫检测法。以1:80稀释作参考,对25份标准阳性血.清和19份标准阴性血清的考核结果证实:在最适条件下,该法特异性,敏感性良好,具有临床和科研应用价值。随后,应用酶联免疫吸附试验对7只实验山羊血吸虫病抗体消长作了长期、细致地观察,结果表明:特异性IgG最早于尾蚴感染后第40天出现;吡喹酮治疗后,7个月消失。     

乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体,应用于猪源性生物制品中JEV的检测。方法提纯病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法三次克隆获得4株杂交瘤细胞,并应用琼脂扩散、酶联免疫吸附试验和免疫荧光方法进行抗体鉴定和样品检测。结果获得4株稳定分泌JEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株G10、F4、C10、A5,免疫荧光抗体实验证实是特异的抗JEV抗体,其免疫球蛋白亚类G10和F4为IgG1,A5为IgM,C10未鉴定出其亚类。G10和F4腹水效价为105以上,C10和A5腹水效价为102以上。结论成功制备了抗JEV单克隆抗体,建立了以单抗介导的间接ELISA和间接IFA检测方法,并应用于猪源性生物制品中JEV的检测。     

芋花叶病毒检测试剂盒的研制

用IPTG诱导融合表达芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DMV)CP基因的菌株,通过12%SDS-PAGE和5%~20%梯度SDS-PAGE二次制备电泳获得纯化的CP免疫家兔,获得经过Western blot分析为特异的抗CP血清.硫酸铵沉淀初步提取IgG,然后用Protein A-Red Sepharose亲和层析进一步纯化IgG,IgG与甘油1∶1混合获得效价1∶3 100的一抗,将一抗、羊抗兔二抗和4-硝基苯基磷酸二钠组成DMV检测试剂盒.用研制的检测试剂盒对芋、魔芋和马蹄莲叶片样品的间接ELISA检测表明,DMV在田间普遍发生,并确定研制的试剂盒完全可用于DMV检测.     

小麦GLB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以小麦主要过敏原Glb-1蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。采用细胞融合和有限稀释法相结合的方法快速筛选获得稳定分泌的特异性杂交瘤细胞株,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水并用蛋白A亲和层析法纯化抗体后检测。采用间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的IgG亚型;通过间接ELISA鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。利用双单抗夹心ELISA法检测单抗的抗原表位特异性。结果表明:共获得4株可稳定分泌小鼠抗小麦主要过敏原Glb-1蛋白的单克隆抗体,分别命名为1C4、4H5、1A9、4F5,经检测其Ig亚型均为IgG1,且4株单抗效价均在10-9以上。ELISA结果分析表明该4株单抗均能特异性识别小麦主要过敏原Glb-1蛋白且和其他常见食物无交叉反应性。将4株单抗两两配对进行ELISA实验,结果发现1C4与4H5可能有不同的抗原表位,以此建立的双抗夹心ELISA系统可以检测小麦Glb1-G3蛋白。实验成功制备了鼠抗小麦主要过敏原Glb-1蛋白抗原的单克隆抗体,并且建立了双单抗夹心ELISA检测系统,为小麦主要过敏原蛋白的检测奠定了基础。     

重组金针菇免疫调节蛋白的纯化及生物活性研究

目的研究重组的金针菇免疫调节蛋白(re FIP-fve)对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用、诱导小鼠脾淋巴细胞对白细胞介素-2(IL-2)的促分泌作用及对血细胞的凝集作用.方法采用离子交换色谱法,利用SP Sepharose XL色谱柱纯化重组的免疫调节蛋白;将纯化后的蛋白作用于小鼠脾淋巴细胞和血细胞,用MTT法检测蛋白对脾细胞增殖和血细胞凝集的影响;用ELISA法检测蛋白对淋巴细胞分泌细胞因子的作用.结果经过SP Sepharose XL色谱柱纯化后可获得纯度为86%的重组蛋白;纯化蛋白浓度在80μg/m L时最大限度促进细胞增殖;蛋白浓度在2μg/m L时开始出现凝血;ELISA检测结果显示:重组的金针菇免疫调节蛋白能明显增强小鼠脾淋巴细胞分泌白细胞介素2(IL-2)的水平.结论经过SP Sepharose XL色谱柱纯化后可获得纯度较高的蛋白;纯化后的蛋白与小鼠脾淋巴细胞共同培养,不仅可以促进脾细胞的增殖,而且能增强小鼠脾淋巴细胞分泌白细胞介素2的水平;蛋白与血细胞共同培养能够促进血细胞的凝集.