人锰超氧化物歧化酶hSOD2-Q46K突变体的表达与功能分析

目的:构建人锰超氧化物歧化酶(hSOD2)-Q46K突变体,简化获得hSOD2突变体的步骤,探讨hSOD2结构与功能的关系.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)体外定点突变技术将hSOD2的46位Q氨基酸突变为K氨基酸,经测序鉴定正确后将p ET15b-hSOD2-Q46K突变体重组质粒转化Rosetta-gami大肠杆菌,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达.利用SWISS-MODEL Workspace对hSOD2-Q46K突变体进行同源建模,利用Swiss-Pdb-Viewer软件对建模结果进行分析.利用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白后用超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒检测目的蛋白的SOD活力.利用浓度为0.1 mmol/L百草枯(PQ)压力下生长情况测定表达hSOD2-Q46K和hSOD2蛋白的Rosetta-gami大肠杆菌的抗氧化能力.结果:测序结果表明46位密码子已由CAG突变为AAG.经过IPTG诱导后野生型和突变体均能表达出大小约为25 k Da的蛋白.SOD活性检测表明hSOD2-Q46K突变体的活力为899 U/mg,比野生型蛋白活性下降了65.4%.三维结构分析显示,突变点周围氨基酸间氢键被部分打破.结论:成功构建hSOD2-Q46K突变体并成功得到了纯化的突变体蛋白,hSOD2-Q46K的SOD活力比野生型降低了65.4%,且百草枯压力下表达hSOD2-Q46K蛋白的大肠杆菌A600达到0.84,而野生型蛋白的大肠杆菌A600达到1.14.这可能是因为突变点与周围氨基酸间氢键打破,突变点周围失去了原来的稳定结构,底物通道入口处氨基酸排列疏散,影响电子在氨基酸间的传递,影响静电导向机制,从而阻碍氧自由基在底物通道的通行,使hSOD2的催化活力下降.     

脱毛碱性蛋白酶(DHAP)的饱和突变

本实验在同源建模和氨基酸序列比对的基础上, 选取脱毛碱性蛋白酶（DHAP）8个氨基酸位点进行饱和突变. 通过牛奶平板和96孔板发酵筛选, 获得了4个催化特性改良的突变体, 测序鉴定为D248F, D248S, M233L和W214K. 利用酪蛋白和合成肽(AAPL pN)作为底物, 对这些突变体进行了评价, 结果表明D248F、D248S、W214K在常温(28℃)下的酪蛋白水解活性提高; M233L在常温、高温(50℃)的酶活以及热稳定性都有增加. 同时, M233L和W214K在25℃和50℃水解AAPL pN的酶活也分别得到了不同程度的提高.     

人类神经生长抑制因子突变体E55/58/60Q和E58K的研究

人类神经生长抑制因子(GIF)又称MT3,其α 结构域存在一个特殊的插入六肽,其中含有多个谷氨酸残基,这些谷氨酸残基被认为与GIF具有保护神经元活性有关.为更好地研究这些Glu的作用,分别制备了E55/58/60Q和E58K2个突变体蛋白并对其稳定性进行了初步研究.结果显示,突变体蛋白的一系列光谱性质同野生型MT3非常一致,对酸的稳定性和对EDTA及DTNB的反应性上,也都表现出同野生型蛋白相似的性质.实验表明MT3α 结构域插入段中的Glu残基对蛋白的金属 硫簇结构及其稳定性没有显著的贡献.     

关于固氮酶的作用机理和活性中心結構

本文根据固氮酶已知的反应和络合催化原理,讨论了固氮酶的作用机理和活性中心结构;提出了由Fe_2S_2·Mo_2O_2原子簇构成的两个偶联在一起的两钼一铁三核活性中心(2 Mo—1 Fe)的看法;这两个偶联的三核活性中心也是放氢的活性中心.根据这活性中心模型,说明了各种底物分子的还原反应机理和CO只抑制分子氮、炔类、腈类、异腈类等6π-配位体型的底物分子的还原反应,而不抑制放氢反应的原因,以及ATP的作用机理和ATP/2比值与电子倒流的关系.     

丙酮对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力与构象的影响

以丙酮为效应物,研究其对锯缘青蟹(Scylla serrata)N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响,结果表明:该酶的剩余活力随着丙酮浓度增大而呈指数下降,当丙酮浓度达25%,酶的剩余活力仅为20%,说明丙酮对青蟹NA-Gase有明显的失活作用.导致酶活力丧失50%的丙酮浓度为7.5%.在较低丙酮浓度(＜10%)的失活是可逆的反应过程.动力学研究表明,该酶的失活过程属于混合型,并进一步测定游离酶(E)和酶底物络合物(ES)与丙酮的结合常数(K1和K1s),分别为4.06%和10.49%,K1＜K1s,说明底物存在对酶被丙酮的失活作用有一定的保护作用.应用荧光发射光谱研究青蟹NAGase经丙酮微扰后的分子构象变化情况,结果表明:丙酮对酶分子构象有显著的影响,酶的内源荧光强度随丙酮浓度增大而降低,说明酶分子中的生色基团Trp和Tyr残基的微环境发生了变化.     

(K(1,4);2)-图的3-闭包的一个性质

对(K1,4;2)-图这一新的图类,证明它的3-闭包的一个性质:设G为K1∨P4-free的(K1,4;2)-图,a≠b∈E(G),x为G中局部3-连通的适宜点,G′由G在x局部完备所得,则G′中存在最长(a,b)-路P满足|E(P)∩(E(G′)-E(G))|≤1.     

马铃薯贮藏蛋白Patatin及其突变体分子动力学和分子对接的研究

马铃薯贮藏蛋白Patatin具有水解脂肪的能力,且特定位点的突变能够影响Patatin的水解酶活性.Patatin的水解酶活性中心是由Ser77和Asp215组成,首先采用分子动力学方法研究Patatin及其突变体的稳定性和构象变化,通过结构比对没有发现构象规律性的变化,然后采用分子对接方法,发现了两个基团(Patatin及其突变体活性位点Ser77的羟基与底物p-硝基苯基癸酯的酯键)间的距离具有规律性:即H109A和D182A(活性减弱)两个基团之间的距离偏大,而R368A,E140A,H109N(活性增强)两个基团之间的距离偏小,符合之前的生化数据.这说明Ser77的羟基与底物PNPC10的酯键间的距离可能能够影响底物小分子与Patatin蛋白的结合,从而影响Patatin酯酶的活性.同时,根据细胞内溶质磷脂酶A2(cPLA2)反应过程,我们推测了Patatin与底物之间可能的催化机制.     

国外科技期刊亮点

蛋白活性研究新进展 作为一个非常有效的机制,变构调节能够控制诸多生物过程中的蛋白质活动,包括信号转导、新陈代谢、催化和基因调控等。其原理是一些酶除了有活性中心外,还有所谓的变构中心,与配体（或底物）结合可使酶的构象发生改变,影响酶活性中心与底物的亲和力及酶的活性。     

血红蛋白作催化剂酸性铬蓝K褪色法测定过氧化氢

研究了牛血红蛋白(Hemoglobin,Hb)作为过氧化物模拟酶,以酸性铬蓝K(Acid Chrome Blue K,ACBK)作为氢供体底物的酶催化反应体系的催化特性和反应条件,体系在pH9.6的条件下波长为536 nm处有最大吸收,建立了褪色程度ΔA与H2O2浓度的线性关系,从而建立了测定H2O2的新方法.测定过氧化氢的线性范围为4.0×10-7~3.2×10-5mol/L,检出限为2.7×10-8mol/L.该方法用于雨水和消毒水中过氧化氢含量的测定,结果满意,加标回收率在95.0%~100.0%之间.     

组蛋白H3K36位点甲基转移酶识别组蛋白底物的分子机制研究进展

组蛋白H3第36位赖氨酸的甲基化修饰在染色质上含量丰富,与活跃转录以及DNA损伤修复等重要生理过程相关．H3K36位点可以被一甲基化、二甲基化和三甲基化3种形式修饰,目前已知的负责组蛋白H3K36三甲基化修饰的人源蛋白是SETD2,负责组蛋白H3K36二甲基化修饰的酶包含NSD1、NSD2和NSD3和ASH1L共4名成员．这些H3K36甲基转移酶都具有非常特异的H3K36位点选择性,因此,对调控体内H3K36甲基化修饰的水平和分布十分重要．此外,它们的表达异常与人类的多种疾病相关．因此,解析组蛋白H3K36甲基转移酶识别并修饰组蛋白底物的分子机制,对揭示这些酶参与的表观遗传调控机制及其在体内的生理功能都具有十分重要的意义．早期的研究使得人们对组蛋白H3K36甲基转移酶催化底物的机制有了较深入的认识,但是由于解析的修饰酶与底物复合物的结构较少,对这些酶特异识别组蛋白底物分子机制的认识尚有很多不足．近年来,随着冷冻电镜技术的应用,H3K36甲基转移酶与核小体底物的复合物结构相继取得了突破,极大地推进了人们对这些酶识别并催化组蛋白底物分子机制的认识．本文以这几个组蛋白H3K36甲基转移酶为主要目标,对其分子机制的最新进展进行介绍总结．      

定点突变提高豆豉纤溶酶的酶活力和底物特异性的研究

以pBE—DFE质粒为模板,采用反向长距离PCR技术对豆豉纤溶酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme,DFE)基因进行定点突变,使位于酶的底物结合区第156位的谷氨酸和第166位的甘氨酸分别替换为丝氨酸和丙氨酸,使临近酶的底物结合区的第169位甘氨酸残基替换为丙氨酸,获得了三个突变体E156S,G166A和G169A.将含突变基因的表达载体转化枯草杆菌WB800,构建了豆豉纤溶酶基因突变体的表达菌株WB800(E156S);WB800(G166A)和WB800(G166A).将3种表达菌株进行液体发酵培养,结果发现发酵上清液中纤溶酶的纤溶活性为460,790和900U/mL,分别是未突变酶活性(660U/mL)的70%,115%和136%;3种突变酶对合成底物的H-D-Val-Leu-Lys-pNA的酰胺水解活性是未突变酶的17%,125%和121%.     

298 K时四元体系Na+,K+/Cl-,HCO-3-H2O和 Na+,K+/SO2-4,HCO-3-H2O溶解度预测

基于盐的溶解平衡条件及稳定共饱点的判别原理,用Pitzer模型的HW公式对四元体系Na+,K+/Cl-,HCO - 3-H2O和Na+,K+/SO2- 4,HCO- 3-H2O在298 K的溶解度进行了预测,并绘出了这两个体系的相图:前者有两个共饱点,NaCl,NaHCO3,KCl 和KHCO3四个相区;后者有三个共饱点,Na2SO4·10H2O,K3Na(SO4)2,K2SO4,NaHCO3和KHCO3五个相区.     

大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的ATCase突变酶,得到三个突变体:M1(H20L)、M2(K60E)、M3(K94E),并在E.coli DH5α中对融合蛋白进行了表达.酶活测定表明,M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高,分别为野生型M0的1.10、1.22和1.37倍,且比活力都有不同程度提高.与含野生型pyrBI基因的M0相比,含突变型基因的M1、M2和M3均对15,mmol/L的CTP具有强的抗反馈抑制作用,且M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5.4、6.0和8.5倍.最后将各突变质粒转入到E.coli Cyt10(Δcdd)中进行发酵培养,结果表明,与未含突变基因菌株相比,各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高,说明ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化.     

重组纤溶酶原激活剂及其突变体的表达研究

利用PCR技术 ,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPAcDNA的缺失突变体———rPA ;在此基础上 ,运用定点突变技术 ,得到rPA的定点突变体———rPA(KHRR2 96～ 2 99AAAA) ,rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR2 96～2 99AAAA A473S) ;将rPA及其 3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET 2 8a( )中 ,获得表达载体pErA ,pErA(K) ,pErA(A)和pErA(KA) .酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变 .表达载体转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS PAGE电泳分析发现 ,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白 ,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达 ;蛋白产量分别占菌体总蛋白的 35 .97%与 37.71% ,分子量均为 39.6kD .Westernblotting显示 ,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应 .该产物经初步纯化后进行复性与活性 (mFAPA)测定 ,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性 .以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了基础     

图K_(2n)\E(K_(1,5)))(n=10,11)的点可区别边染色

讨论了图K2n\E(K1,5))(n=10,11)的点可区别边染色,得到图K2n\E(K1,5))(n=10,11)的点可区别边色数为χvd′(K2n\E(K1,5)))=2n.     

人类神经生长抑制因子突变体ESS／58／60Q和E58K的研究

人类神经生长抑制因子(GIF)又称MT3，其α—结构域存在一个特殊的插入六肽，其中含有多个谷氨酸残基，这些谷氨酸残基被认为与GIF具有保护神经元活性有关，为更好地研究这些Glu的作用，分别制备了E55／58／60Q和E58K 2个突变体蛋白并对其稳定性进行了初步研究。结果显示，突变体蛋白的一系列光谱性质同野生型MT3非常一致，对酸的稳定性和对EDTA及DTNB的反应性上，也都表现出同野生型蛋白相似的性质。实验表明MT3 α—结构域插入段中的Glu残基对蛋白的金属—硫簇结构及其稳定性没有显著的贡献。     

Paenibacillus sp.K1 α-半乳糖苷酶酶学性质

利用CODEHOP PCR和Anchor-ligated PCR方法从类芽孢杆菌Paenibacillus sp.K1中克隆得到一个α-半乳糖苷酶基因aga P1,大小为2 190 bp,同源性分析显示,该基因与其他α-半乳糖苷酶基因的序列相似低,是一个新的α-半乳糖苷酶基因。将aga P1在大肠杆菌Origami B(DE3)中表达并纯化获得Aga P1,酶学性质分析显示:以p NPG为底物时,Aga P1最适反应温度为40℃,最适p H 6.5~10,Km值为0.75 mmol/L,最大反应速率Vmax为1.96μmol·min-1·mg-1。同时Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+和甘油能使α-半乳糖苷酶酶活提高1~3倍,而Cu2+、Zn2+、Fe3+和还原型谷胱甘肽则抑制该酶的活性。SDS-PAGE检测Aga P1蛋白大小约为80 ku,与理论预测值基本一致;Native-PAGE分析表明正常条件下Aga P1蛋白以二聚体或六聚体形式存在。以上结果显示,Paenibacillus sp.K1产生的α-半乳糖苷酶为一个新的低温α-半乳糖苷酶。     

脱毛碱性蛋白酶定点突变的初步分析

来自于Bacillus pumilus菌株BA06的碱性蛋白酶DHAP具有良好的脱毛能力. 为了更好地了解DHAP的催化特性和进一步改造使之更加符合制革工艺的要求, 根据蛋白质同源建模和嗜冷嗜热酶氨基酸组成的统计分析结果, 确定了13个氨基酸位点进行定点突变. 通过牛奶平板和对粗酶液在不同温度和热稳定性方面的活性进行了分析. 结果发现位于DHAP空间结构上底物结合“口袋”开口处α-螺旋上的氨基酸残基(E220, V223和K244)严重影响酶的活性; 位于底物结合口袋袋底的三个保守位点V256L、V25     

大麦黄花叶病毒抗性突破株系的分子变异

通过大麦黄花叶病毒 (Ba YMV)抗性突破株系的核酸 RNA1全序列分析并与野生株系比较表明 ,抗性突破株系在病毒复制酶或转运蛋白区域 (6K2 )和核酸 RNA复制酶区域 (NIb)存在二个变异位点 .在这二个位点上抗性突破株系核酸分子编码的氨基酸分别为脯氨酸 (Pro)和苏氨酸 (Thr) ,而野生株系分别为缬氨酸(Val)和丙氨酸 (Ala) .对该两种酶蛋白质二级结构分析显示 ,氨基酸的变异可能导致了蛋白质的结构、功能与性质的改变 ,并且此种变异与抗 Ba YMV冬大麦中抗性基因 ym4的功能丧失有关 ,同时也说明了大麦品种田间致病性的差异与病毒核酸分子中的点突变关系密切 .     

循环赛图K(i)2n与边矩阵K''''2n的K-边着色

为了让一个2n阶的完全图K2n变成一个可用于循环赛安排的循环赛图K(i)2n,给出了边矩阵和循环赛图的定义,提出了利用边矩阵K'2n的k-边着色求求解完全图K2n的k个完备匹配Mi的算法.介绍了循环赛图K(i)14,K(i)16,…,K(i)32的构造结果及其应用.