C-反应蛋白的研究:1.驴C反应蛋白的纯化与理化性质

1930年Tillet和Francis在炎症急性期病人血清中观察到有一种能特异性地与肺炎球菌细胞壁C多糖发生沉淀反应的蛋白质,后来被命名为C-反应蛋白(简称CRP)。 最初,CRP被认为是一种抗体,后来的实验证明它不是抗体,而是典型的非特异性的炎症急性期的反应性蛋白质。用放射免疫方法测定,CRP在正常动物血清中仅微量存在(平均为1340ng/ml血清),当动物患有组织损伤或炎症时,血清中CRP含量便成千倍地增加,几乎与组织损伤或炎症的程度成正比。当病理状况恢复正常时,CRP含量也下降。     

C-反应蛋白检测在ST段抬高心肌梗死中的应用

目的研究ST段抬高心肌梗死(STEMI)血清CRP浓度的动态变化及溶栓治疗对CRP浓度的影响。方法选择ST段抬高心肌梗死患者67例,按是否再通分为再通组和未再通组,选择同期住院的非冠心病患者36例作为对照组,测定各组血清CRP浓度,并动态观察STEMI患者血清中CRP的变化,对比分析各组间CRP浓度的差异。结果STEMI患者血清中CRP浓度较正常对照组明显升高(P＜0.01)；溶栓再通组再通后CRP浓度迅速下降,与未再通组相比,差异有显著性(P＜0.01)。结论成功的溶栓治疗可使STEMI患者血清中CRP浓度迅速下降,动态检测血清CRP浓度有利于观察STEMI患者病情演变过程,有助于评价病情和疗效观察。     

C-反应蛋白检测在ST段抬高心肌梗死中的应用

目的研究ST段抬高心肌梗死(STEMI)血清CRP浓度的动态变化及溶栓治疗对CRP浓度的影响.方法选择ST段抬高心肌梗死患者67例,按是否再通分为再通组和未再通组,选择同期住院的非冠心病患者36例作为对照组,测定各组血清CRP浓度,并动态观察STEMI患者血清中CRP的变化,对比分析各组间CRP浓度的差异.结果STEMI患者血清中CRP浓度较正常对照组明显升高(P＜0.01);溶栓再通组再通后CRP浓度迅速下降,与未再通组相比,差异有显著性(P＜0.01).结论成功的溶栓治疗可使STEMI患者血清中CRP浓度迅速下降,动态检测血清CRP浓度有利于观察STEMI患者病情演变过程,有助于评价病情和疗效观察.     

C-反应蛋白检测在ST段抬高心肌梗死中的应用

目的研究ST段抬高心肌梗死(STEMI)血清CRP浓度的动态变化及溶栓治疗对CRP浓度的影响.方法选择ST段抬高心肌梗死患者67例,按是否再通分为再通组和未再通组,选择同期住院的非冠心病患者36例作为对照组,测定各组血清CRP浓度,并动态观察STEMI患者血清中CRP的变化,对比分析各组间CRP浓度的差异.结果STEMI患者血清中CRP浓度较正常对照组明显升高(P＜0.01);溶栓再通组再通后CRP浓度迅速下降,与未再通组相比,差异有显著性(P＜0.01).结论成功的溶栓治疗可使STEMI患者血清中CRP浓度迅速下降,动态检测血清CRP浓度有利于观察STEMI患者病情演变过程,有助于评价病情和疗效观察.     

心力衰竭中 C-反应蛋白检测应用

本文对急性左心衰竭,慢性全心衰竭患者作了治疗前及治疗后血清C-反应蛋白（CRP）定量测定,同时与排除感染、恶性肿瘤等心功能正常的心血管病患者作对照。结果发现,急性左心衰竭组中81．2％患者治疗前血清CRP浓度显著升高,治疗好转后浓度迅速下降。两者间有非常显著差异,慢性充血性心衰治疗前血清CRP浓度轻微升高,治疗前后无显著差异,对照组CRP含量正常,无变化。     

C-反应蛋白的研究3.熊C-反应蛋白的分离纯化和性质

C-反应蛋白(CRP)是一种急性炎症期的血清蛋白,它能与肺炎球菌细胞壁上的C-多糖结合而产生沉淀。对CRP的性质和生物学功能已有不少报导。CRP的有些生物学性质类似免疫球蛋白,但CRP的作用是非专一性的,在化学结构上与免疫球蛋白也不同。另外Robey发现CRP还可以和染色质结合,他认为CRP可能在清除损伤细胞的DNA上起重要作用。     

白鲫鱼C-反应蛋白提取条件的优化

探讨了白鲫（Carassius auratus cuvieri）C反应蛋白（CRP）亲和层析法提取过程中,不同的硫酸铵饱和浓度、缓冲液pH值、缓冲液离子强度和配基浓度下对白鲫CRP的提取效率的影响.结果发现,在硫酸铵饱和浓度80%,缓冲液pH值8.5,缓冲液离子强度为0.05 mol/LTris以及配基浓度为8μmol/mL介质的条件下,白鲫CRP的提取效率最高.     

白鲫鱼C-反应蛋白提取条件的优化

探讨了白鲫(Carassius auratus cuvieri)C反应蛋白(CRP)亲和层析法提取过程中,不同的硫酸铵饱和浓度、缓冲液pH值、缓冲液离子强度和配基浓度下对白鲫CRP的提取效率的影响.结果发现,在硫酸铵饱和浓度80%,缓冲液pH值8.5,缓冲液离子强度为0.05 mol/LTris以及配基浓度为8 μmol/mL介质的条件下,白鲫CRP的提取效率最高.     

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)多克隆抗体的制备

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)属于SLC38家族,参与小的中性氨基酸跨膜转运,在哺乳动物组织中广泛表达.SNAT2的功能紊乱可以导致许多神经性疾病,如阿尔茨海默症、帕金森症等.采用PCR方法扩增得到SNAT2氨基端75个氨基酸的编码序列,构建重组质粒pET28a-SNAT2-75aa,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达重组蛋白.利用组氨酸标签蛋白经镍柱亲和纯化后得到了纯度在95%以上的SNAT2氨基端蛋白SNAT2-75aa,将其作为免疫原免疫新西兰大白兔,从而获得SNAT2多克隆抗体.采用巯丙基琼脂糖凝胶6B(Thiopropyl sepharose)固定抗原亲和纯化法进一步对该抗体进行纯化,纯化后的抗体效价至少提高10倍.蛋白免疫印迹确定该抗体对SNAT2具有高度的特异性,表明SNAT2多克隆抗体制备的成功,为进一步研究SNAT2蛋白的结构和功能奠定了生化基础.     

E-cadherin前体蛋白抗体的制备与鉴定

E-cadherin是一种重要的肿瘤转移抑制因子,它的功能异常能够导致肿瘤细胞的转移.细胞内成熟的E-cadherin由其前体蛋白剪切而成,目前还没有针对该前体蛋白的特异性抗体.为了得到能用于检测内源性E-cadherin前体蛋白(E-cadherin pre)的抗体,对E-cadherin基因用限制性内切酶PstⅠ和PvuⅡ进行双酶切,获取E-cadherin基因的N-端片段,将其重组入原核表达载体pGEX-4T-2中,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达重组蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠子纯化后,得到较高纯度的E-cadherin前体抗原.用该抗原免疫新西兰兔,获得抗血清,进一步纯化血清得到抗E-cadherinpre的多克隆抗体.用Western blot检测了外源性和内源性E-cadherin pre,发现该抗体效价高且特异性强;免疫荧光实验表明该抗体可以用于细胞染色,为深入研究E-cadherin pre在细胞内的功能奠定了基础.     

GST融合蛋白包涵体纯化方法的探索

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

血清肿瘤坏死因子-α与C反应蛋白检测原发性高血压的临床价值

探究血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与C反应蛋白(CRP)检测原发性高血压的临床价值。选取秦安县王尹镇卫生院收治的157例经临床诊断确诊为原发性高血压患者作为研究组,将同期于秦安县王尹镇卫生院进行体检的健康人群126例作为对照组,所有研究对象均于清晨空腹抽取采血按标准制备血清,使用ELISA法检测血清中TNF-α及CRP含量。比较两组血清TNF-α水平及CRP水平。两组血清TNF-α、CRP水平比较,研究组均明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);将研究组157例原发性高血压患者按照血压水平高低进行分级,其中1级62例,2级56例,3级39例。3个级别TNF-α、CRP水平比较,2级、3级明显高于1级,且3级明显高于2级,差异均具有统计学意义(P0.05)。原发性高血压患者血清TNF-α水平及CRP水平均明显高于健康人群,且随着高血压级别上升,血清TNF-α水平及CRP水平明显升高。通过对血清TNF-α水平及CRP水平进行检测,能有效对原发性高血压患病情况及病情分级进行判断,有利于疾病治疗及预防。     

羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d的原核表达、鉴定及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d基因的克隆,原核表达,以及纯化,根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白Omp25d蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为650bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-Omp25d。在大肠杆菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用Western-blot分析方法鉴定GST-Omp25d蛋白。结果成功地构建了pGEX-4T-1-Omp25d原核表达载体并在大肠杆菌中表达了Omp25d基因,纯化后所获得的融合蛋白与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应。表明研究成功构建了pGEX-4T-1-Omp25d元和表达载体,并且在大肠杆菌中进行表达,纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。     

人P53的原核表达及包涵体复性研究

通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础.     

重组SARS冠状病毒S蛋白的原核表达研究

目的克隆表达SARS冠状病毒的主要结构蛋白(S蛋白)。方法合成SARS冠状病毒S蛋白特异性基因片断并克隆入pET32a原核表达载体,转化BL21菌,经IPTG诱导高效表达得到重组S蛋白,并通过W estern印迹对重组蛋白质进行鉴定。结果重组蛋白质经镍柱亲和层析得到了部分纯化,免疫动物后得到SARS病毒的多克隆抗体。结论经E lisa检测,表达的重组S蛋白基本具备检测病人血清中抗SARS病毒IgG和IgM的能力,可进一步用于S蛋白功能研究与SARS诊断试剂盒的研制。     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10的表达、纯化和鉴定

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

人C-反应性蛋白的提纯及检测

以胸腔渗出液为来源,用硫酸铵分级沉淀,DEAE—cellulose离子交换柱层析和快速蛋白质液相分离仪纯化了C—反应性蛋白。纯化的C—反应性蛋白经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫电泳、Ouchterlony免疫扩散及快速蛋白质液相分离鉴定,纯度达100％。用这种纯化的C-反应性蛋白(CRP)免疫山羊所得的抗-CRP抗血清特异性好,用抗血清制就的CRP检测板和日本(KW)CRP检测板作对照测试,经060例验证,作Radit分析,P>0.05,表明两者质量无显著性差异。     

降钙素原、白细胞计数以及C反应蛋白在新生儿感染性疾病中的应用

目的:通过检测患有新生儿感染性疾病的患儿血清中的降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)和血液中的白细胞计数(WBC)水平,探讨其对新生儿感染性疾病中辅助诊断作用.方法:选用临床确诊为患有感染性疾病的新生患儿42例,健康新生儿30例,检测其血清中的PCT、CRP以及血液中的WBC,用统计软件Spss 17.0进行数据分析.结果:42例新生患儿中PCT阳性率(PCT≥0.5 ng/mL为阳性)为90.5％,WBC阳性率(WBC＞ 20×109/L为阳性)为28.5％,CRP阳性率(CRP ＞8 mg/L为阳性)为44.7％,三者在新生儿感染性疾病中均升高,但是PCT阳性率明显高于CRP和WBC,存在显著差异性(P＜0.01).结论:PCT、WBC和CRP对新生儿感染性疾病的诊断,鉴别诊断和指导临床早期用药有一定的价值,而且相比于WBC和CRP,PCT是一个能够更早,更灵敏地反映新生儿感染性疾病的指标.     

血清C反应蛋白水平与急性脑梗死病情及预后的关系

目的探讨急性脑梗死患者血清C反应蛋白（CRP）水平的变化与病情严重程度及其预后的关系。方法分别测定大动脉粥样硬化性脑梗死患者（LAA组）78例、腔隙性脑梗死患者（LCI组）36例和健康体检者（对照组）40例血清CRP含量,并进行比较。按脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分（NDS）标准对患者进行评分。结果LAA组CRP含量高于LCI组,LCI组高于对照组（P〈0．05）;IAA组中,CRP异常率高于LCI组（P〈0．05）,CRP异常的患者NDS评分的改善低于CRP正常组,且CRP异常者预后中无变化者高于正常对照组（P〈0．01）。结论CRP水平增高与脑梗死的发生和严重程度预后有密切关系。     

羊布鲁菌外膜蛋白OMP2b的克隆，原核表达及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白 OMP2b 基因的克隆,原核表达,以及纯化。根据羊布鲁菌 M5株外膜蛋白 OMP2b 蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为1130bp 的目的基因片断,克隆入融合表达载体 pGEX-4T-1,构建重组质粒 pGEX-4T-1-omp2b。在大肠埃希菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用 Western-blot 分析方法鉴定纯化蛋白。结果成功构建了 pGEX-4T-1-omp2b 原核表达载体并在大肠埃希菌中表达了 omp2b 基因,纯化后所获得的蛋白与目的蛋白大小一致且与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应,说明其为布鲁菌 OMP2b 蛋白。本研究成功构建了 pGEX-4T-1-omp2b 原核表达载体,并且在大肠埃希菌中进行表达,纯化的 OMP2b 蛋白具有良好的免疫原性。