Armillariella tabescens阿拉伯糖苷酶基因全长cDNA的克隆与表达

通过对假密环菌(Arm illariella tabescens)的表达cDNA克隆文库进行随机测序,获得一段与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列同源性很高的EST序列(AJ620046).根据获得的EST序列用SMART-RACE技术成功从假密环菌中克隆出了阿拉伯糖苷酶基因的全长cDNA,用生物信息学的方法对所获的序列进行信息学分析.分析结果显示其全长cDNA为1 016 bp,其最长的开放阅读框架为924 bp,编码307个氨基酸,该全长cDNA序列与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列具有较高同源性,80~279位氨基酸序列属于阿拉伯糖苷酶超家族,58~184位氨基酸是一个典型的结构功能域,蛋白分子质量预测为32 881 u,等电点为4.59.构建重组质粒pPIC9-AF,并在毕赤酵母菌GS115中对所获得的基因进行了表达,相对酶活达到了81.25%.     

Bacillus sp.XJ1-05菌株GbsA基因的克隆及其生物信息学分析

根据地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC 14580的GbsA基因(GeneID:3027576)的核甘酸序列设计1对特异性引物.通过PCR的方法扩增由本实验室分离的中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05的GbsA基因,经T/A克隆,插入到pBS-T载体上进行序列测序,结果表明得到的GbsA基因的开放阅读框(ORF)全长为1473bp.在Genbank数据库中进行同源性检索,结果表明:其与Bacillus licheniformis ATCC 14580的GbsA基因的氨基酸序列同源性高达97%.生物信息学分析表明:该GbsA基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,高亲水性,有2个醛脱氢酶作用位点.     

禽巴氏杆菌株粘附蛋白基因的克隆和序列分析

用PCR从禽巴氏杆菌P-1059基因组DNA中分别扩增编码粘附蛋白OmpH,PtfA,PlpE和PM1665的基因序列,将PCR产物克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,经菌落PCR筛选含有重组质粒DNA的重组子,并对目的基因进行测序.DNA测序结果表明,P-1059株ompH,plpE,ptfA和pm1665基因大小分别为1 032,1 008,435,348bp,分别编码343,335,144,115个氨基酸的多肽.Blast分析结果显示,P-1059株与已报道不同血清型巴氏杆菌ompH基因的同源性为95%~97%,与ptfA基因的同源性为95%~99%,与plpE基因的同源性为94%~97%,而与pm1665基因的同源性为99%.克隆得到的ompH,ptfA,plpE和pm1665基因,为禽巴氏杆菌粘附因子及其致病机理的研究奠定基础.     

一个紫红曲霉HR-PKS基因MpER1的克隆及序列分析

利用已知HR-PKS中ER结构域的保守氨基酸序列,通过设计简并引物,并使用本实验设计的巢式PCR方法从紫红曲霉(Monascus purpureus)中成功克隆得到一条长约300 bp的ER基因片段MpER1,再用Genome Walking的方法获得该HR-PKS中ER的基因全长序列.序列分析显示:该ER基因长为936 bp,编码312个氨基酸.将该ER基因序列与已知的ER基因序列比对,发现不同产物的ER基因同源性较差.该ER基因对应的氨基酸序列与A.clavatus 有最高的同源性,为88%.与其他物种如Nectria haematococca、Magnaporthe grisea等有50%左右的同源性.     

甜椒CaHSP22.5基因的克隆及序列分析

为深入研究小分子量热激蛋白对植物胁迫条件下的保护机理,利用RT-PCR结合RACE的方法,克隆甜椒内质网小分子量热激蛋白基因(CaHSP22.5)基因并进行序列分析和转基因烟草分析.获得了包括全长开放读码框(ORF)的CaHSP22.5基因的cDNA序列,与目前已克隆的ERsHSP类基因的同源性分析表明,甜椒CaHSP22.5基因编码的蛋白与马铃薯和番茄的ERsHSP类蛋白的同源性最高.通过叶盘法利用农杆菌介导转化烟草,成功获得了正反义转基因烟草,为进一步研究该基因的功能和作用机制奠定了基础.     

H5N1亚型禽流感病毒M基因的克隆与分子进化分析

以一株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增M基因全长,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,测序结果表明所克隆的982个核苷酸的片段包含了M1和M2基因的完整阅读框架,通过软件推导M1和M2基因分别编码252和97个氨基酸,将M全长序列与Genbank收录的10株H5N1亚型流感病毒M基因序列进行比较,病毒株之间M基因核苷酸序列同源性为92.3%～99.3%,编码的两个蛋白M1和M2氨基酸序列间同源性分别为为96.0%～98.8%和92.9%～99%,分子进化分析揭示了病毒株间的亲源关系.     

中度嗜盐菌GbsB基因的克隆、序列分析及生物信息学分析

为构建耐盐的转基因植物提供材料,根据地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisATCC 14580的GbsB基因的核甘酸序列设计1对特异性引物,通过PCR的方法扩增由分离的中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05的GbsB基因,经T/A克隆,插入到pBS-T载体上进行序列测序,采用NCBI-BlastX软件在Genbank数据库中进行同源性检索,结果表明:得到的GbsB基因的开放阅读框(ORF)全长为1209bp,编码1个由402个氨基酸残基组成的蛋白质;其与Bacillus licheni-formisATCC 14580的GbsB基因的氨基酸序列同源性高达96%。生物信息学分析表明:该GbsB基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,高亲水性,有2个乙醇脱氢酶作用位点。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分离

以黑曲霉基因组DNA、mRNA为模板,利用种属相似性设计了一对引物,采用PCR与RT-PCR技术得到β-葡萄糖苷酶基因的DNA和cDNA全序列.测序表明:克隆得到的DNA序列全长2 924 bp,cDNA序列全长2 583 bp,编码860个氨基酸.编码序列推导的蛋白质序列相似性分析显示:完整蛋白质序列同源性高达97%～99%.该研究为β-葡萄糖苷酶基因的遗传转化及应用 奠定了基础.     

纳豆杆菌纳豆激酶成熟肽基因的克隆与同源性分析

纳豆杆菌 (Bacillusnatto)是从日本传统食品纳豆中筛选出来的 ,它具有较强的溶栓作用 .根据已发表的纳豆激酶基因序列设计一对引物 ,利用聚合酶链式反应 (PCR) ,从纳豆杆菌的基因组DNA中扩增和克隆到纳豆激酶基因 .序列分析表明 ,该纳豆激酶基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献已报道的序列分别有 93.4 %和 94 .5 %的同源性 ,显示了极高的同源性 .但该基因与该室克隆的豆豉溶栓酶基因的同源性仅为 80 .1%,这表明纳豆激酶与豆豉溶栓酶确实不是同一种酶 .     

牛结核分枝杆菌PstS3基因克隆与序列分析

以牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）基因组DNA为模板,克隆PstS3基因,并进行序列测定,然后利用生物信息学软件对其序列进行分析.结果显示,PstS3基因全长1 113 bp,编码370个氨基酸,与GenBank所发表的人结核分枝杆菌PstS3基因的核苷酸同源性为99.82%,氨基酸同源性为99.4%,有1处位点发生有义突变.