第一代EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌的耐药机制

非小细胞肺癌(NSCLC)是全球肿瘤发病率及死亡人数最高的肿瘤.每年全球被诊断为NSCLC的患者超过100万.在我国肺癌的发病率和死亡率已居恶性肿瘤的首位,其中NSCLC占80%以上.作为治疗NSCLC的药物,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)给EGFR基因敏感突变的患者带来了巨大的临床获益.随着临床和基础实验研究的逐步深入,EGFR-TKI已经越来越受到关注.晚期非小细胞肺癌治疗已取得了突破性进展,酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的代表药物为厄洛替尼和吉非替尼,这两种药物已在全球范围内得到广泛认可并被大量用于晚期非小细胞肺癌的治疗,尤其是关于EGFR阳性敏感突变者.然而在经过一段时间(一般为7～13个月)的治疗后,大部分患者会对EGFR-TKI产生耐药,其耐药机制主要包括原发性和获得性耐药.EGFR-TKI在改善晚期非小细胞肺癌患者无进展生存期和总生存期方面有着突出作用,因此EGFR-TKI耐药机制的探索已成为研究的热点,本文旨在对第一代EGFR-TKI药物的耐药机制进行综述.     

自噬与肿瘤EGFR抑制剂耐药的研究进展

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)这种酪氨酸激酶受体在许多类型实体肿瘤的发生及生长过程中起着主要作用,因而针对性地应用EGFR抑制剂已被批准作为多种类型肿瘤的治疗方法.然而,先天性或获得性耐药问题限制了这类药物的疗效.自噬作为细胞内废弃物降解的一种方式,被认为与肿瘤EGFR抑制剂耐药相关. EGFR抑制剂能诱导自噬,然而该作用是双向的.自噬既能减弱EGFR抑制剂的细胞毒性作用而介导肿瘤耐药,也会在过度自噬的情况下促进细胞死亡而逆转肿瘤耐药.因此,调节自噬水平有可能为克服肿瘤患者EGFR抑制剂耐药提供更多思路.     

EGFR19和21外显子突变的NSCLC的临床特征及对EGFR-TKIs的效果比较

目的探讨晚期非小细胞肺癌(NSCLC)不同的表皮生长因子受体(EGFR)敏感突变类型对表皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)疗效的相关性。方法回顾性收集新疆医科大学附属肿瘤医院2011—2016年确诊晚期NSCLC并接受EGFR-TKI治疗的病例。采用Kaplan-Meier单因素、Cox多因素分析方法,探讨晚期NSCLC患者接受EGFR-TKIs的生存情况及影响因素。结果共收集226例接受EGFR-TKI治疗的EGFR敏感的NSCLC患者,19del突变113例,21 L858R突变113例。多因素分析结果显示,EGFR突变类型是PFS的独立影响因素。经一线EGFR-TKI治疗的NSCLC患者含19del突变组的PFS优于21 L858R突变(P=0.038),经二三线EGFR-TKI治疗,19del突变组的PFS优于21 L858R突变(P=0.012)。结论经EGFR-TKI治疗的NSCLC患者含19del突变组的PFS显著优于21 L858R突变。     

新疆石河子地区非小细胞肺癌EGFR基因突变分析

目的分析新疆石河子地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测情况及其与临床病理特征的关系。方法收集720例确诊为NSCLC患者(包括已行EGFR基因突变检测的239例)的完整病史资料,分析EGFR基因突变情况与病理特征的相关性。结果新疆石河子地区NSCLC患者EGFR突变检测率为38.1%。检出EGFR突变113例(47.3%);女性患者突变率(63.6%)高于男性(35.7%),两者之间差异有统计学意义(P=0.000);腺癌患者突变率(52.7%)明显高于非腺癌患者(12.5%),差异有统计学意义(P=0.000);19Del突变率为41.6%,21L858R突变率为37.2%;NSCLC患者中19Del突变在女性患者中较男性常见(P=0.001),L858R突变男女间差异无统计学意义(P=0.58);腺癌中男性19Del突变率(15.5%)低于女性(29.9%)(P=0.013),L858R突变男女差异无统计学意义(P=0.796)。结论新疆石河子地区NSCLC患者EGFR突变检测率偏低,有待提高;该地区EGFR突变主要见于腺癌,女性患者;突变类型主要为19Del及21L858R,其中女性患者19Del突变比男性多见。     

Cpf1 和 Cas9核酸酶靶向EGFR-L858R突变的研究

表皮生长因子受体(EGFR)单核苷酸突变(2573TG,L858R)占所有EGFR突变的90%.使突变的EGFR失活对有此突变的病人非常有利.这里,应用双荧光报告分析的方法分析规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)系统中Cpf1和Cas9在靶向EGFR-L858R突变的编辑效率.在EGFR-L858R突变位点的附近,有两个Cpf1前间区序列邻近基序(PAMs)——TTTN.并且,2573TG突变形成了一个Cas9的PAM——NGG.因此本文通过构建两条AsCpf1的gRNAs(gRNA1和gRNA2)和一条SpCas9的gRNA(gRNA3)在体外通过双荧光蛋白分析系统去评估SpCas9和AsCpf1特异性靶向等位基因的能力.结果证实了AsCpf1和SpCas9都能够特异性的编辑突变的EGFR(2573TG).     

四川地区利福平耐药结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区突变分析

本文对268株结核分枝杆菌临床分离株(包括213株利福平耐药株、55株利福平敏感株)rpoB基因RRDR区进行测序并比较分析.结果表明,在213株利福平耐药株中有200株(93.90%)在rpoB基因RRDR区发生了突变,在55株利福平敏感株中RRDR均未发生突变.突变频率最高的类型依次为:531位点(55.87%),526位点(16.43%),516位点(10.33%)和511位点(8.92%),以上四个位点的突变菌株数占所有利福平耐药株的91.55%.四川地区利福平耐药株中511位点突变频率高于全国其他地区.     

EGFR基因C端结构域真核表达载体的构建

构建EGFR基因C端结构域的真核表达载体.应用PCR技术,从含EGFR基因C端结构域的大肠杆菌DH 5α中扩增其序列,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,经酶切及测序进行验证.PCR扩增片段与预期结果相符,真核表达载体构建成功,测序结果与GenBank公布的基因一致.成功地构建了EGFR基因C端两个结构域的真核表达载体.     

甘肃省临夏州、甘南州、定西市结核病耐药现状比较分析

目的了解甘肃省临夏州、甘南州、定西市结核菌对一线药物耐药差异,为我省少数民族及贫困地区结核病防治提供科学依据。方法根据(WHO/IUATLD)结核病耐药监测指南,对成功分离的909例结核分枝杆菌菌株,用绝对浓度间接法进行了药物敏感性实验。对临夏州、甘南州、定西市总耐药、初始耐药、获得性耐药、耐多药及耐药顺位进行分析比较。结果临夏州、甘南州、定西市:初始耐药率17.3%、21.8%、23.5%;初始耐多药率8.2%、5.5%、6.3%;获得性耐药率55.0%、31.0%、48.0%;获得性耐多药率31.9%、9.1%、16.0%。临夏州、甘南州、定西市初始耐药及初始耐多药没有差异;临夏州获得性耐药率高于甘南州;临夏州获得性耐多药率高于定西市和甘南州。结论临夏州、甘南州、定西市耐药的发生高于WHO其他监测地区。获得性耐药、耐多药及耐药顺位各区域间存在明显差异,临夏州、甘南州、定西市耐药现状及各区域间的差异应引起卫生主管部门及各级结核病防治机构的重视。     

抗菌药物对大肠杆菌防突变浓度研究

通过测定临床常用抗菌药物对大肠杆菌的防突变浓度(MPC)、耐药突变选择窗(MSW)、及耐药选择性指数(SI),为临床治疗提供抗菌药物用药参考,以降低细菌耐药情况的发生.方法:采用琼脂稀释法分别测定利福平、头孢羟氨苄、头孢地尼对大肠杆菌ATCC25922的MPC及SI.结果:利福平对大肠杆菌的MPC,MSW及SI分别为32μg/mL、12～32μg/mL、2.67;头孢羟氨苄的MPC,MSW及SI分别为30μg/mL、17～30μg/mL、1.76;头孢地尼的MPC、MSW及SI分别为0.5μg/mL、0.28～0.5μg/mL、1.78;结论:头孢地尼的抑菌效果明显高于其余两种药物,且其在较低浓度水平即可抑制耐药菌株的产生、防止耐药情况出现.     

僧帽牡蛎EGFR基因的原核表达及其在幼体附着变态过程中的表达特性

扩增僧帽牡蛎(Crassostrea gigas angulata)的表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)基因,并与pET32a(+)载体连接,构建pET32a(+)/EGFR重组质粒.将重组质粒导人大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),成功地表达并纯化了一个50 ku的重组蛋白.采用RT-PCR技术,检测了僧帽牡蛎幼体附着变态前后EGFR基因表达量的变化,结果表明,EGFR基因在附着变态前的浮游幼体阶段和附着变态24 h后的稚贝阶段低表达,附着后1～6 h强烈表达,这预示着EGFR基因在僧帽牡蛎幼体附着变态这一生物学过程中具有重要作用.     

结核病耐药性分析

通过观察耐药肺结核患者的临床特征,为临床治疗耐药肺结核提供依据。选取定西市100例耐药肺结核患者为研究对象,观察患者的胸片检查结果,比较各年龄组患者的获得性耐药和原发性耐药情况、治疗期间患者痰菌转阴情况以及治疗后出现的不良反应。青年组原发性耐药率明显高于中年组和老年组,差异具有统计学意义(P0.05)。临床治疗耐药肺结核应重视不同年龄阶段耐药肺结核患者的耐药情况,应严格执行相关标准,以避免患者产生耐药和出现耐药菌株。     

利用二代测序数据判定SNP基因型

通过将二代测序数据与连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR)对单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因分型的结果进行比对,确定二代测序数据判定SNP基因型的经验性阈值.利用多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,multiplex PCR)对91个样本进行19个SNP位点的扩增,扩增的产物混匀纯化后在Ion torrent PGM仪器上进行二代测序.利用LDR技术对相应的SNP位点进行检测,将其分型结果作为二代测序数据判定SNP基因型的标准,确定了二代测序数据判定SNP基因型的阈值:测序深度≥6X,等位基因比率在15%~85%的位点为杂合子,在范围之外的为纯合子,该阈值准确度达到99.6%;针对等位基因频率分布在阈值边缘的数据,结合聚类分析可将正确率提升至100%.研究结果为利用二代测序数据判定SNP基因型提供了一个准确、快捷和经验性的阈值与方案.     

牛结核分支杆菌临床分离株rpsL，rpoB，KatG基因突变分析

采用噬菌体生物扩增法对本实验室分离鉴定的25株奶牛结核分支杆菌进行药敏分析,检测出14株耐链霉素、利福平、异烟肼菌株．用PCR扩增耐药株的rpsL基因片段（370bp）、rpoB基因片段（213bp）和KatG基因片段（458bp）,并对目的片段进行测序分析,其中5株耐链霉素菌株的rpsL基因在43位点发生突变,均由赖氨酸密码子（AAG）突变为精氨酸密码子（AGG）;5株利福平耐药株的rpoB基因在531位点、526位点、5¨位点发生突变,其中有3株分离株的rpoB基因在531位点发生点突变,1株分离株的rpoB基因在526位点发生突变,1株分离株的rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变．     

连接酶检测反应技术应用于乙型肝炎病毒拉米夫定耐药和阿德福韦耐药突变的研究

目的:研究高温连接酶检测反应技术(LDR)技术检测乙肝病毒拉米夫定耐药和阿德福韦耐药突变的可行性.方法:应用LDR技术和多聚酶链式反应(PCR)技术,在乙肝病毒基因相关区域设计引物和探针检测突变位点.结果:该方法能很好的区分野生型质粒和突变型质粒;90例临床样本的测序结果与LDR检测结果基本一致.结论:LDR技术可以应用于临床乙肝病毒样本的拉米夫定耐药和阿德福韦耐药的检测.     

EGFR抑制剂耐药拮抗策略在非小细胞肺癌治疗中的进展

自噬即细胞自我"消化",不仅与肺癌的发生发展密切相关,还与癌细胞耐药的形成有关.细胞的自噬水平可由表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)等多种信号通路进行调控.靶向治疗药物表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)可以有效阻断下游信号通路,并广泛应用于治疗晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC). EGFR-TKI疗效肯定但容易产生耐药,而且还能诱导肿瘤细胞自噬活性.最新研究表明,使用自噬诱导剂或抑制剂调节自噬水平,可延缓EGFR-TKI的耐药性,提高其治疗非小细胞肺癌的效果.     

鼻咽癌NAP1(18～44)融合表达载体的构建、表达纯化及初步研究

通过PCR扩增及定点突变等构建了pET-DsbA/NAP1 (18～44)融合表达载体,将其转化入大肠杆菌BL21后获得可溶表达.通过镍亲和柱,Thrombin酶切及G50分子筛对鼻咽癌NAP1(18～44)进行了纯化并进行了质谱鉴定.NAP1(18～44)的圆二色谱和2D 1HNMR DQF-COSY谱表明鼻咽癌肽段在TFE溶液中能形成一定的α螺旋.这些工作为进一步用核磁共振技术研究NAP1(18～44)打下了基础.     

光电子成像:走向新的世纪

半个世纪以来,光电子成像(主要包括微光成像和热成像)技术取得了惊人的发展,显示出极为辉煌的前景.在微光成像技术方面,发展了一代、二代和三代直视像增强技术,真空和固体微光摄像技术及光子计数成像技术;在热成像技术方面,发展了致冷型一代、二代和三代热成像技术和非致冷型列阵热成像技术.回顾光电子成像技术自1930年以来的进展,展望新世纪中微光四代像增强技术、新型微光摄像技术和先进的焦平面(FPA)和非致冷型热成像技术的发展.     

反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究

目的:建立起简单、快速、灵敏、准确的慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药位点的反向线性探针(reverse line probe,RLP)检测方法.方法:根据HBV野生及耐药基因序列设计通用探针、3'、5'对称加有poly-C的特异性探针和5'标记生物素的扩增引物.将探针线性固定在硝酸纤维膜上,使HBV PCR扩增产物与探针进行杂交.通过优化杂交条件,建立RLP检测方法.利用该方法对重庆地区86个慢性乙肝病人进行检测,同时与直接测序结果比较.结果:半巢式PCR可对103拷贝/ml的血清样本进行有效特异扩增,新建的RLP检测方法可对PCR扩增产物在1 ng/ml以上,或血清样本中突变型DNA占野生型DNA比例为5％以上的均可有效检测,86例临床的检测灵敏度为100％,野生型和耐药型的检测准确性分别为98.09％(103/105)、100％ (43/43),与直接测序法比,RLP检测野生与耐药混合型准确性更好.结论:反向线性探针杂交检测方法检测HBV拉米夫定耐药位点方便、灵敏、准确,是HBV拉米夫定治疗有效的监控工具,该方法适合临床应用.     

禽传染性支气管炎病毒H52反向遗传株的构建

IBV H52基因组全长27.6kb,分13个1.3~2.9kb的片段扩增H52全长cDNA,额外扩增N-3′片段,并克隆到载体PMD19-T上.利用No see′m技术在每个片段中引入BsaⅠ或BsmBⅠ酶切位点,D1片段中引入沉默突变位点,在5′UTR端和N-3′引入T7启动子,3′UTR端引入Poly(A)尾.将克隆好的13个片段酶切,纯化,体外无缝连接为全长cDNA.将全长cDNA及N-3′体外转录获得它们的转录体,将转录体共转染BHK-21细胞,48h后收获细胞液,将细胞液接种10日龄SPF鸡胚获得反向遗传株H52-R.在鸡胚中盲传5代后,通过RT-PCR对无义突变位点进行扩增及序列分析,在反向株H52-R中发现引入的无义突变位点.对反向株H52-R的一些生物学特性如HA、EID50等测定发现,H52-R的这些生物学特性与亲本株H52相似.     

治疗NSCLC的EGFR靶向性药物设计与筛选

计算了现有的治疗非小细胞肺癌(NSCLC)常见药物的相关参数,总结了以表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶为靶标的药物分子的药效团特征.在Gefitinib的基础上进行了药物分子的组合化学设计,通过虚拟筛选得到了分子对接得分较高的结构分子,并对其进行了预测和模拟.结果表明:新设计筛选出的2种分子在药代动力学和毒性方面...