孕期高雄大鼠子代实验性多囊卵巢综合征模型构建

通过母体高雄环境建立子代实验性多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠模型,并证明此模型大鼠存在卵巢局部胰岛素抵抗。方法是给孕16d的雌鼠皮下注射丙酸睾丸酮,诱导其子代雌鼠发生PCOS,观察子代大鼠体重、动情周期变化、性激素变化及糖代谢变化、卵巢重量和卵巢形态变化、肌肉组织蛋白印迹测定PI-3K和MAPK通路关键蛋白的表达、卵巢免疫组化和蛋白印迹测定PI-3K和MAPK通路关键蛋白的表达确定。结果显示:①动情周期失去规律变化,提示无排卵;②血清17-OHP,A2,T升高;③卵巢组织学检查可镜下看到早期发育的较多的小卵泡、闭锁卵泡,囊状扩张卵泡明显增加,颗粒细胞层数减少,黄体数量明显减少;④OGTT:1h血糖及胰岛素高于对照组,模型组存在着胰岛素抵抗;⑤卵巢局部PI-3K和MAPK途径关键蛋白有表达;⑥卵巢局部蛋白印迹测定PI-3K和MAPK途径关键蛋白IRS-1,P85,GLUT4降低,ERK1升高。由此表明:①此模型大鼠符合PCOS的诊断标准;②此模型大鼠存在卵巢局部胰岛素抵抗。     

丹参酮对滋养细胞胰岛素抵抗下IRS-1和p-ERK表达的影响

为了不同药物干预组的绒毛膜滋养层细胞中胰岛素受体底物-1(IRS-1)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白的表达及其与妊娠期高血压的关系.采用以下方法:①体外原代培养人绒毛膜滋养细胞,用沃漫青霉素作用于滋养细胞诱发胰岛素抵抗的细胞模型;②用蛋白印迹法检测lRS-1和磷酸化细胞外信号调节激酶(P-ERK)在正常组、溶剂组、胰岛素抵抗组、丹参酮组和二甲双胍组中的变化.结果显示:①显微镜下可见细胞呈多边形.细胞平铺生长,有细胞融合后形成的合体滋养层细胞;②当细胞胰岛素抵抗时,IRS-1的GSR为0.685 7.较正常对照组GSR(0.541 7)升高了26.58%,加入药物改善胰岛素抵抗后,丹参酮组的GSR(0.589 0)降低了16.42%.二甲双胍组的GSR(0.642 9)降低了6.66%;③在沃漫青霉素诱发胰岛素抵抗时.P-ERK的GSR为1.7,较正常对照组GSR(1.083 3)升高了56.93%;加入药物改善胰岛素抵抗后丹参酮组的GSR(1.342 5)较抵抗组降低了26.63%,二甲双胍组的GSR(1.542 9)较抵抗组降低了10.18%.由此得出结论:①丹参酮2对IRS-1的胰岛素抵抗改善水平优于二甲双胍;②丹参酮2和二甲双胍对P-ERK均有降调作用;③丹参酮2通过对IRS-1、p-ERK的调节,改善了妊娠期高血压疾病的胰岛素抵抗状态.     

胰岛素增敏剂对卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗的调控作用

以人工诱导卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)细胞模型,观察细胞内关键信号分子的表达以及胰岛素增敏剂的体外作用。通过沃曼青霉素(Wortmannin,WT)特异性地抑制胰岛素传导途径中磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)通路,作用于体外培养的猪卵巢颗粒细胞48h后,再加入曲格列酮、二甲双胍、小檗碱、隐丹参酮48h,观察对IR的改善情况。以葡萄糖氧化酶法检测细胞对葡萄糖的消耗量,以蛋白印记法(Western Blot)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光PCR法,检测葡萄糖转运蛋白4(Glut4)、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)表达。结果表明:胰岛素糖代谢途径被WT阻滞,IR细胞对培养基中葡萄糖的摄取明显抑制。二甲双胍、小檗碱和隐丹参酮,都能使葡萄糖摄取增加,但稍逊于曲格列酮。IR细胞的Glut4的表达下降,MAPK和PPAR-γ表达升高;胰岛素增敏剂可以部分逆转IR细胞的上述信号蛋白的表达异常,以曲格列酮作用最为显著。总之,WT阻断PI-3K途径产生IR,胰岛素增敏剂能改善IR,隐丹参酮和小檗碱增敏的作用类似二甲双胍,而曲格列酮作用最为显著。     

甘草次酸、水飞蓟宾对体外培养的胰岛素抵抗猪卵巢颗粒细胞的影响

 多囊卵巢综合征(PCOS)患者往往伴有卵巢细胞的胰岛素抵抗及激素水平的异常,胰岛素增敏剂能够缓解PCOS患者的症状。本研究利用地塞米松诱导的猪体外卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗,探讨中药单体甘草次酸及水飞蓟宾作为胰岛素增敏剂对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞异常激素分泌的改善情况,从而阐明中药单体的疗效机制,进而扩大中药单体的临床应用。结果表明,地塞米松作用后,体外培养的猪卵巢颗粒细胞分泌睾酮(T)增加,同时伴有17α羟化酶(CYP17)mRNA表达量的上调,AMPK(一磷酸腺苷酸活化蛋白激酶)mRNA表达降低,芳香化酶(P450arom)变化不明显。甘草次酸和水飞蓟宾都能够通过提高AMPK mRNA的表达水平,降低胰岛素抵抗颗粒细胞的雄激素分泌能力及CYP17 mRNA的表达水平。结果显示,中药甘草次酸和水飞蓟宾显著抑制了胰岛素抵抗细胞过高的雄激素分泌能力。卵巢细胞AMPK途径的激活可能是中药胰岛素增敏剂治疗PCOS高雄激素血症的途径之一。     

基因芯片研究隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响

应用基因芯片技术,从基因水平分析隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响.采用猪卵巢颗粒细胞作为体外研究对象,利用磷酯酰肌醇-3激酶(PI-3K)特异性抑制剂--沃曼青霉素人工诱导猪卵巢胰岛素抵抗的细胞模型,以0.02 g/L隐丹参酮进行干预,继续培养48 h后,以Trizol法提取总RNA,采用猪全基因表达谱芯片技术筛选出差异表达基因.隐丹参酮组与沃曼处理组相比,共筛查出42个差异基因,其中22个基因表达下调,20个基因表达上调.研究表明,隐丹参酮可以通过调节多个基因、作用多个信号途径来改善胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞的状态.     

卵巢自身胰岛素抵抗放大其颗粒细胞增殖功能

探讨在卵巢自身胰岛素抵抗情况下,颗粒细胞增殖能力、雌激素合成能力的改变。方法是以猪卵巢颗粒细胞作为体外研究对象,利用磷酯酰肌醇-3激酶(PI-3K)特异性抑制剂——渥曼青霉素(Wortamanni,WT)人工诱导胰岛素抵抗的细胞模型。结果显示:①处理组细胞的葡萄糖摄取能力明显低于正常组细胞的葡萄糖摄取能力(756.25±158.81cpm/2×104cellsvs1144.75±81.09cpm/2×104cells,p<0.05);②处理组细胞中有丝分裂激活蛋白激酶1(MAPK1)和MAPK2蛋白的表达水平高于对照组,而该蛋白磷酸化p-MAPK蛋白的表达低于对照组;③处理组卵巢细胞MAPK、增殖细胞核抗原(PCNA)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达(相对灰度)升高;④在胰岛素抵抗的状态下,雌激素以及芳香化酶的表达显著上调。结论为卵巢颗粒细胞的自身胰岛素抵抗,明显提高其分裂增殖能力和雌激素合成效能,该机制可能是PCOS卵巢在超排过程中易发卵巢过度刺激综合的重要机制。     

基因芯片研究小檗碱对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响

应用基因芯片技术研究小檗碱对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达谱的影响。方法采用胰岛素信号转导通路调节糖代谢的关键分子——PI-3K的特异性阻断剂沃漫青霉素作用于猪卵巢颗粒细胞,人工诱导胰岛素抵抗(IR)的细胞模型;同时应用小檗碱作用在细胞模型上,作用48h后提取细胞总RNA,应用猪全基因组单通道芯片对样本基因进行筛查,得出差异表达基因数据并进行分析。结果显示,中药小檗碱作用模型细胞后差异表达基因42个。差异表达基因主要涉及的功能有:物质代谢、炎症与免疫反应、信号转导等。由此可得出结论:小檗碱可通过多种途径在基因水平上对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞起作用。     

小麦烷基间苯二酚对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗改善作用及机制

低度慢性炎症状态是肥胖导致机体胰岛素抵抗的重要原因之一。小麦烷基间苯二酚(alkylresorcinols, ARs)是全麦食品膳食的生物标记物和重要的活性功能成分。利用体外炎症因子诱导,建立3T3-L1成熟脂肪细胞胰岛素抵抗模型,通过检测脂肪细胞脂质分解和葡萄糖吸收与利用情况,探讨小麦ARs在炎症状态下对脂肪细胞胰岛素抵抗的保护机制。研究结果表明:不同浓度小麦ARs(5~20μmol/L)干预能够剂量依赖性地改善炎症因子诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗,脂肪细胞对葡萄糖利用率分别提升了4.3%、10.2% 和24.0%;小麦ARs可以显著缓解炎症因子导致的脂肪细胞脂质分解。进一步机制解析发现:炎症因子显著降低了脂肪细胞糖代谢两个关键蛋白Akt的磷酸化(p-Akt)及其下游GLUT4蛋白表达,导致其葡萄糖利用障碍,而ARs干预显著提升了这两个蛋白的表达;采用PI3K抑制剂(LY294002)预处理脂肪细胞后,ARs 对于脂肪细胞p-Akt及GLUT4表达的增加被抑制,相应的对于葡萄糖吸收的改善作用也被显著降低,脂肪细胞脂质分解增加,表明ARs通过特异性激活p-Akt/GLUT4信号通路改善了3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗。最后,研究了小麦ARs的5种主要单体成分分别对于脂肪细胞胰岛素抵抗的改善作用,结果表明,十七烷基间苯二酚是小麦ARs发挥生理功能的主要活性物质。     

有氧运动对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌组织PTP1B表达的影响

选用健康雄性SD大鼠, 在高脂饮食诱导胰岛素抵抗的基础上,观察有氧运动对大鼠骨骼肌组织中蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)表达的影响. 结果表明,有氧运动能够降低胰岛素抵抗大鼠骨骼肌组织中PTP1B表达,从而改善胰岛素抵抗水平.     

甘丙肽拮抗剂M35对糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响

探讨甘丙肽拮抗剂（Galantide）M35对运动糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响。糖尿病大鼠随机分为4组：糖尿病安静组、糖尿病运动组、糖尿病安静M35组、糖尿病运动M35组。用药组腹腔注射甘丙肽拮抗剂M35,对照组腹腔注射同剂量的生理盐水。用正糖钳方法、血浆胰岛素浓度和骨骼肌葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）含量来了解胰岛素抵抗水平。糖尿病M35组实验前血浆胰岛素浓度和实验后相比,呈非常显著性降低;糖尿病安静M35组骨骼肌葡萄糖输注速率、GLUT4蛋白含量比糖尿病运动M35组均降低。甘丙肽拮抗剂降低了糖尿病运动大鼠的胰岛素敏感性,其机理可能是抑制GLUT4的活性或降低GLUT4的转位实现的。     

运动对2型糖尿病胰岛素抵抗相关因子的影响研究

通过分析运动对2型糖尿病胰岛素抵抗的相关因子的影响,发现2型糖尿病主要是胰岛素抵抗和胰岛素分泌受损所导致.因此,只要了解胰腺β细胞的胰岛素抵抗程度,就可以加以弥补,使葡萄糖耐受性维持正常.     

罗格列酮对老年2型糖尿病合并高血压患者血压的影响

目的:观察胰岛素增敏剂罗格列酮用于老年2型糖尿病合并高血压的患者时,降低血浆胰岛素水平以及改善胰岛素敏感性后对血压的影响。方法:23例老年2型糖尿病合并高血压患者口服罗格列酮(文迪雅)4mg～8mg,1次/日。治疗前后测定BMI、血压、HbA_(1C)、FBG、PBG、FINS、PINS,并按HOMA模型计算胰岛素抵抗指数、胰岛素分泌指数和药物的不良反应。结果:(1)罗格列酮治疗12周后,BMI治疗前后比较无显著性差异;血压治疗后明显下降,降压幅度达(6.75±0.03)/(7.25±0.53)mmHg,与治疗前比较有显著性差异。(2)治疗后HbA_(1C)、FBG、PBG、FINS、PINS均明显下降,治疗前后比较有显著性差异。(3)治疗后HOMA-IR下降,IAI升高,与治疗前比较有显著性差异,FINS/FBG无显著性差异。(4)我国老年患者使用罗格列酮的安全性及耐受性较好。结论:罗格列酮治疗中国老年2型糖尿病患者,能降低血浆胰岛素水平,改善IR,显著降低收缩压和舒张压;且其安全性、耐受性均较好。     

A simple, economical method of converting gene expression products of insulin into recombinant insulin and its application

A method, by which the gene expression product of recombinant single chain insulin can be converted into insulin by directly digesting with trypsin, has been established. This method has been used in process of porcine insulin precursor (PIP), [B16Ala]PIP and [B26Ala]PIP into (desB30)insulin, (desB30)[B16Ala]insulin and (desB30)[B26Ala]insulin, respectively, and all of them retain full biological activity of that of their corresponding parent, recombinant human insulin, [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin. The results further demonstrate that the C-terminal residue of B chain is not necessary for insulin's biological activity. Compared with the method of transpeptidation, this method is simple, with a high yield, and avoids the use of organic reagents, and in comparison with the trypsin/carboxypeptidase method, it omits the use of carboxylpeptidase. Besides, (desB30)[B16Ala]insulin and (desB30)[B26Ala]insulin still remained without self-association property as that of their parents, which demonstrate that they are monomeric insulin. So they can be used for substituting for monomeric insulin, [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin, in clinical applications.     

Crystallization and preliminary crystallographic analyses of human insulin mutant B9(Ser→Asp) in different aggregation forms

B9(Ser→Asp) insulin, one of the fast-acting insulin mutants produced by protein engineering, has been crystallized. Three crystal forms have been obtained, which belong to or-thorhombic, tetragonal and rhombohedral system, respectively. Each crystal form contains different aggregation units of the mutant, i.e. dimer or hexamer. The diffraction data of the former two have been collected beyond 0.2 nm resolution. The structural analyses and comparisons will provide some information about insulin' s self-association and the structural basis of the fast absorption produced from the mutation.     

蛋白水解酶转肽使猪胰岛素转成人胰岛素

利用赖氨酸专一性的蛋白水解酶进行了酶促人胰岛素半合成反应，猪胰岛素经该酶切去Ｂ链羧基端丙氨酸形成去丙氨酸胰岛素素ＤＡＩ。进一步在水／有机溶剂介质中该酶的转肽反应，使Ｂ链生成苏氨酸叔丁酯羧基末端，水解去酯后产生人胰岛素。研究了转肽反应的最佳条件。转肽反应生成的人胰岛素具有较强的生物活性。     

卵泡膜细胞的胰岛素抵抗对其雄激素合成的影响以及胰岛素增敏剂的调控机制

为探索卵泡膜细胞人工诱导胰岛素抵抗后其雄激素合成的变化,以及胰岛素增敏剂曲格列酮、二甲双胍对胰岛素抵抗卵泡膜细胞的调控作用,采用猪卵巢内卵泡膜细胞进行体外培养,地塞米松诱导,构建胰岛素抵抗的细胞模型,用曲格列酮和二甲双胍分别处理模型细胞,检测培养液中葡萄糖和激素水平的变化以及胰岛素信号分子和雄激素合成关键酶的mRNA表达变化.结果表明:卵巢内卵泡膜细胞发生胰岛素抵抗后能明显增进其雄激素合成能力:曲格列酮、二甲双胍均能降低胰岛素抵抗的卵泡膜细胞的糖代谢异常和雄激素水平.