IL-8对角膜成纤维细胞胶原合成的影响

促炎因子IL-8在圆锥角膜患者泪液中表达较高,但其作用机制尚不明确。胶原合成和降解异常是圆锥角膜的发病机制之一。通过探讨IL-8对正常角膜成纤维细胞胶原蛋白合成的影响及其分子机制,为进一步揭示圆锥角膜的发病机制提供参考。构建siRNA干扰体系,通过siRNA技术沉默角膜成纤维细胞中IL-8的表达;采用实时荧光定量PCR分析沉默IL-8后,促炎因子以及胶原合成和降解相关基因的表达变化;采用ELISA法检测总胶原的含量;采用明胶酶谱法检测MMP-2的活性;采用Western blot法检测沉默IL-8后相关信号途径关键蛋白的变化。结果发现:沉默IL-8表达后,角膜成纤维细胞总胶原含量及胶原合成基因(COL1A2,COL3A1,COL5A3,COL6A1)的表达显著升高,而胶原降解酶MMP-2的表达和活性下降;此外,沉默IL-8能够降低IL-6、IL-1β、VEGFA/VEGFR2基因和下游AKT、ERK1/2蛋白的表达。结果表明,IL-8调节角膜成纤维细胞中其他促炎因子及VEGF的表达,并通过PI3K/AKT、ERK信号通路负调控角膜成纤维细胞中胶原的合成,参与MMP-2介导的胶原降解过程。     

机械牵拉对角膜成纤维细胞氧化应激、炎性因子和MMP-9表达的影响

探讨机械牵拉对人角膜成纤维细胞氧化应激水平、抗氧化能力、炎性因子及基质金属蛋白酶(MMP)表达的影响。对体外培养的正常人(NC)及圆锥角膜患者(KC)角膜成纤维细胞进行周期性机械牵拉(幅度15%,频率0.1 Hz,时间12 h).采用荧光染色法检测活性氧自由基(ROS)水平;采用实时荧光定量PCR检测抗氧化酶基因表达;采用酶联免疫吸附试验方法检测炎性因子和MMP-9表达。结果发现:静态培养条件下, KC细胞ROS水平、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、MMP-9均明显高于NC细胞;与静态培养组比较,机械牵拉显著增加了NC和KC细胞ROS、炎性因子和MMP-9蛋白表达水平;并使NC细胞部分抗氧化酶基因表达上调,但不同KC患者细胞牵拉后抗氧化酶表达不同。结果提示力学刺激可能通过处于较高氧化应激状态的圆锥角膜成纤维细胞释放更多的炎性因子,进而上调MMPs的表达,加速角膜细胞外基质降解,促进圆锥角膜的发生与发展。     

MiR-548d-3p调节过氧化氢刺激下人圆锥角膜成纤维细胞IL-1β的表达

氧化应激和炎性因子与圆锥角膜发病密切相关。MiRNAs作为重要的基因表达调控因子参与了角膜的生理病理过程。为了探讨MiRNAs是否通过靶向IL-1β调控圆锥角膜成纤维细胞中与基质重塑相关基因的表达,通过生物信息学软件预测可能与IL-1β靶定的MiRNAs(miR-21-5p, miR-24-3p, miR-26b-3p, miR-27b-5p, miR-181d-5p, miR-383-3p, MiR-548d-3p, miR-4700-3p),对体外培养的人圆锥角膜成纤维细胞添加过氧化氢处理0,6,12,24 h,采用实时荧光定量PCR检测上述MiRNAs及IL-1β基因的表达,并通过双荧光素酶报告分析实验确定MiR-548d-3p与IL-1β之间存在靶定关系。将MiR-548d-3p的模拟物转染至人圆锥角膜成纤维细胞内,发现在氧化应激条件下,MiR-548d-3p的模拟物可显著下调IL-1β的基因表达,并使MMP-1和MMP-3表达下降、Collagen I-α2表达升高。提示氧化应激条件下,人圆锥角膜成纤维细胞MiR-548d-3p可通过下调IL-1β表达促进角膜基质合成,减少降解,进而减缓圆锥角膜病变进程,为圆锥角膜患者治疗提供潜在靶点。     

TNF-α和机械牵拉对圆锥角膜成纤维细胞MMP/TIMP及IL-6表达的影响

研究肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)与机械牵拉对圆锥角膜成纤维细胞白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、基质金属蛋白酶-1,-3(matrix metalloproteinase-1,-3,MMP-1,-3)、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1,-2(tissue inhibitors of metalloproteinase-1,-2,TIMP-1,-2)基因表达与蛋白合成的影响。对体外培养的圆锥角膜成纤维细胞进行牵拉幅度12%、频率0.1Hz的周期性牵拉6h,并给予1ng/mL TNF-α处理,采用Real-Time PCR技术检测细胞中IL-6,MMP-1,MMP-3,TIMP-1,TIMP-2mRNA的表达,ELISA方法检测蛋白的含量。TNF-α单独作用可以诱导圆锥角膜成纤维细胞IL-6、MMP-1以及MMP-3的基因表达与蛋白合成(p0.05),对TIMP-1、TIMP-2的基因表达与蛋白合成无明显影响,提高MMP-1/TIMP-2以及MMP-3/TIMP-2蛋白浓度的比值(p0.05);机械牵拉单独作用促进IL-6、MMP-1以及MMP-3的基因表达与蛋白合成(p0.05),下调TIMP-1、TIMP-2的基因表达与蛋白合成(p0.05),上调MMP/TIMP蛋白浓度的比值(p0.05);两者联合作用则表现出协同效应(p0.05).提示TNF-α和机械牵拉可能通过上调IL-6及MMP/TIMP的比例促进圆锥角膜基质降解,加剧角膜组织破坏,导致角膜膨隆的发生发展。     

机械拉伸对人角膜基质细胞水通道蛋白AQP1表达的影响

通过探讨机械拉伸对人角膜基质细胞中水通道蛋白1(AQP1)及下游信号通路相关基因表达的影响,为揭示圆锥角膜等术后并发症的发生机制提供参考。采用FLEX-4000对人角膜基质细胞进行周期性机械拉伸处理,采用Fluo-3荧光探针检测细胞内Ca~(2+)的浓度,ELISA法检测拉伸处理后胞内cAMP的含量,Real-time PCR分析拉伸和Ca~(2+)螯合剂BAPTA处理后AQP1及其下游信号通路相关基因的表达变化。结果发现:机械拉伸可诱导角膜基质细胞中AQP1及其下游FAK、Wnt通路相关基因的表达。机械拉伸处理后胞内Ca~(2+)、cAMP含量显著上升。BAPTA能够抑制拉伸诱导的AQP1及下游ARHGEF2、Wnt11、MMP2基因的表达。结果提示机械拉伸能够通过调节胞内Ca~(2+)浓度和cAMP浓度促进AQP1的表达,并进一步通过下游的FAK、Wnt信号通路诱导MMP2的表达,参与角膜细胞外基质代谢的调节。     

周期性牵拉与TNF-α对角膜成纤维细胞增殖的影响

利用Flexcell4000柔性基底拉伸系统对角膜成纤维细胞实施应变为5%或15%、频率为0.1Hz的周期性牵拉载荷,用质量浓度为1ng/mL或10ng/mL的肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)处理,并采用流式细胞仪检测细胞周期,研究周期性牵拉与TNF-α对角膜成纤维细胞增殖的影响。结果表明:5%周期性牵拉或TNF-α单独作用对正常及圆锥角膜成纤维细胞S期细胞比例均无显著性影响;15%牵拉使正常及圆锥角膜成纤维细胞S期细胞比例均显著下降;与正常角膜相比,15%牵拉和TNF-α共同作用使圆锥角膜S期细胞比例下降更显著。周期性牵拉及TNF-α可能通过抑制圆锥角膜基质细胞增殖参与圆锥角膜的发生和发展。     

黄芪多糖对脂多糖诱导肠上皮细胞IPEC-J2氧化应激和炎症反应的缓解作用

为探究黄芪多糖对脂多糖诱导IPEC-J2细胞炎症反应的影响.将IPEC-J2细胞分为对照组、LPS处理组、ASP处理组和ASP+LPS处理组,分别检测各组细胞活力、抗氧化指数、相关炎症因子含量和mRNA表达水平.结果表明当10 mg/L LPS作用细胞12 h后,显著降低了细胞活力.当100 mg/L ASP预处理细胞4 h后显著提高了细胞的存活率.与对照组相比,LPS组显著提高了MDA含量并降低了SOD,CAT酶活力,显著上调细胞上清液中IL-6,IL-8和TNF-α的含量以及细胞内三者基因mRNA的表达水平,显著下调了IL-10基因mRNA的表达.而采用ASP预处理4 h后可显著降低细胞内MDA含量及提高SOD和CAT酶活力,且显著下调IL-6,IL-8和TNF-α的含量和细胞内三者基因mRNA的表达及显著上调IL-10基因的表达.试验表明ASP可缓解LPS引起的氧化应激和炎症反应,抑制IL-6,IL-8和TNF-α含量及其基因表达,促进IL-10基因表达,从而发挥抗氧化和抗炎作用.     

胶原支架材料的制备与表征

分别采用真空高温脱水和化学交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺处理经冷冻干燥后的胶原海绵材料,制备组织工程支架,讨论反应条件对胶原性能的影响,测定胶原支架的力学强度和降解特性.结果发现,不同的处理方法都能保持胶原海绵的三维多孔结构,孔隙率可达到90%;真空高温脱水获得的胶原海绵材料力学强度较小,但断裂伸长率略大;碳化二亚胺交联胶原海绵材料力学强度相对较高,抗张强度为380 kPa左右.胶原海绵交联后,降解速率显著小于未经交联的胶原材料.细胞培养试验表明成纤维细胞可以在支架材料上正常生长.两种交联方法处理胶原海绵,其细胞生长行为差异无显著性,适合于作为组织工程支架.     

qking基因对大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

为探讨qking基因对大鼠心肌成纤维细胞(Cardiac Fibroblast,CF)增殖及胶原合成的影响,进一步完善心肌纤维化的相关机制;为改善心机重构提供新的思路,采用胶原酶消化,差速贴壁法原代培养SD乳鼠心肌成纤维细胞,以血管紧张素II(AngII)诱导CF建立增殖及胶原合成模型,运用western-blot法,RT-PCR法,流式细胞术观察过表达qking对CF增殖及胶原合成的影响.结果在CF中血管紧张素II诱导了qking表达时间依耐性的降低,在24 h后降至谷底.过表达qking后通过western-blot法及RT-PCR法检测了CF中增殖细胞核抗原(PCNA)及胶原蛋白1a/3a表达水平的变化,流式细胞术观察细胞周期,数据表明qking基因编码的QKI-6蛋白亚型的过表达能明显抑制CF的增殖;而对于CF中胶原合成未见明显影响.说明qking基因编码的QKI蛋白对CF增殖发挥负性调节作用,但对胶原合成并无明显影响.     

白藜芦醇对紫外线诱导家蝇氧化损伤的保护作用

为了研究白藜芦醇(Res)在紫外线照射家蝇幼虫氧化应激模型中的抗氧化作用,本实验利用原核表达系统获得家蝇顺乌头酸酶重组蛋白,并制备多克隆抗体;对家蝇幼虫分别进行紫外线照射和投喂白藜芦醇后再进行紫外线照射的处理,利用试剂盒检测不同处理组的氧化指标,包括活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化;同时检测不同处理组的家蝇顺乌头酸酶(MdACO)表达水平及活性变化.实验结果显示紫外线照射后的家蝇幼虫体内ROS水平、MDA含量、SOD活性以及MdACO的蛋白表达水平显著高于正常对照组,MdACO活性比正常对照组降低约35%;投喂白藜芦醇后再进行紫外线照射的家蝇幼虫ROS水平、MDA含量、MdACO的表达水平及酶活性与未经白藜芦醇和紫外线处理的空白组无明显差别.结果表明白藜芦醇可以保护机体应对紫外线引起的氧化应激.     

蝉花提取物促进酿酒酵母寿命延长的机制研究

本实验探究蝉花提取物(Cordyceps cicadae extracts,CCE)促进酿酒酵母抵抗H_2O_2诱导的氧化胁迫并延长其时序性寿命的机制.实验使用不同浓度的CCE处理酿酒酵母细胞,检测细胞的时序性寿命.然后通过H_2O_2诱导酿酒酵母细胞氧化胁迫,检测CCE处理组和不加药对照组的抗氧化胁迫能力以及细胞内的活性氧(ROS)水平的变化.酿酒酵母细胞经CCE处理后,通过实时荧光定量实验在mRNA水平检测抗氧化基因SOD2、GPX2、CTT1的表达量.结果显示CCE能够延长酿酒酵母时序性寿命,并且其作用随CCE浓度的增加而增强.此外,在H_2O_2诱导的氧化应激下,CCE预处理的细胞抗氧化胁迫能力增强,细胞内ROS水平显著降低.这些结果表明CCE延长了酿酒酵母的时序性寿命并通过上调CTT1和SOD2从而抵抗H_2O_2诱导的氧化胁迫.     

周期性机械拉伸对兔角膜成纤维细胞MMP-2/TIMP-2及TGF-β1表达的影响

研究了周期性机械拉伸对角膜成纤维细胞外基质中金属蛋白酶-2(Matrix metalloprotei-nase-2,MMP-2)、组织金属蛋白酶抑制剂-2(Tissue inhibitors of metalloproteinase-2,TIMP-2)及转化生长因子-β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)表达的影响。对正常兔角膜成纤维细胞进行幅度分别为5%、10%及15%的周期性机械拉伸,并分别于拉伸后6h、24h取细胞培养液,采用ELISA方法检测MMP-2、TIMP-2及TGF-β1的含量。当拉伸幅度为5%时,6h、24h后,MMP-2、TIMP-2及TGF-β1的含量与静态对照组相比均无统计学差异;当拉伸幅度为10%时,6h后MMP-2、TIMP-2及TGF-β1的含量与静态对照组相比无统计学差异,24h后MMP-2的含量显著升高(p<0.05);当拉伸幅度为15%时,6h后MMP-2、TIMP-2及TGF-β1的含量与静态对照组相比仍无统计学差异,拉伸24h后MMP-2、TGF-β1含量显著升高,TIMP-2含量显著降低(p<0.05)。结果表明,在体外以一定的幅度周期性拉伸角膜成纤维细胞一定时间后,细胞分泌的MMP-2、TIMP-2及TGF-β1发生显著改变,三者相互作用,共同调节角膜成纤维细胞的生物学行为。     

兔皮Ⅰ型胶原的提取、改性与性能研究

采用酸溶、酶溶相结合的方法,从兔皮中提取了胶原蛋白.通过SDS-PAGE对其进行定性分析,利用FT-IR及TG/DTG表征其理化性能.结果表明,所提胶原为I型胶原,保持了完整的三股螺旋结构;热处理过程中,在100℃之前,200～450℃之间和450℃以后有3次明显失重.经戊二醛交联改性后,该胶原的含水量为(78.7±1.3)%,酶降解率从(88.65±0.11)%降为(6.03±0.38)%(p0.01).采用细胞生长抑制法测定了改性胶原对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF-WT)的细胞毒性.结果表明,改性胶原对MEF-WT细胞无明显毒性,毒性评价为0级或1级.该胶原可用于组织工程.     

肝细胞生长因子对体外缺血/再灌注星形胶质细胞氧化应激的影响

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)对体外缺血/再灌注导致的星形胶质细胞氧化应激的影响.方法:取体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞,建立缺血/再灌注损伤细胞模型.用HGF预处理星形胶质细胞后,进行缺血/再灌注.测定细胞活力、活性氧簇(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽(GSH)含量.RT-PCR检测细胞Nrf2 mRNA的表达,Western blotting检测胞浆和胞核Nrf2蛋白的表达.结果:星形胶质细胞缺血/再灌注后,细胞活力降低,ROS水平及MDA含量升高,SOD活性及GSH含量降低.Nrf2 mRNA及胞浆、胞核Nrf2蛋白水平均下调.HGF能明显升高细胞活力,降低ROS水平及MDA含量,升高SOD活性及GSH含量,上调Nrf2 mRNA及胞浆、胞核Nrf2蛋白的表达.结论:HGF能减轻体外缺血/再灌注导致的星形胶质细胞氧化应激损伤,可能与HGF调节Nrf2表达及核转位水平、调控氧化/抗氧化系统的平衡有关.     

融合蛋白GSH-bFGF的构建、表达及体外活性检测

目的:设计构建和表达新型融合蛋白谷胱甘肽-碱性成纤维细胞生长因子(Glutathione-basic fibroblast growth factor,GSH-b FGF),并检测其体外抗氧化、抗衰老能力.方法:采用RT-PCR,酶切,连接,转化等分子克隆技术构建新型融合蛋白GSH-b FGF,并通过镍柱亲和层析、阳离子交换层析纯化该目的蛋白.通过CCK-8试剂盒检测GSH-b FGF对鼠源成纤维细胞NIH-3T3的促增殖活性.同时,经总抗氧化检测试剂盒检测GSH-b FGF的抗氧化能力.结果:克隆表达并纯化获得融合蛋白GSH-b FGF.CCK-8促增殖结果显示质量浓度为20 ng/m L的GSH-b FGF可显著促进鼠源成纤维细胞NIH-3T3增殖.体外抗氧化结果显示GSH-b FGF有显著的抗氧化活性,纯化得到的GSHb FGF蛋白的GSH浓度约为(0.06±0.02)μmol/L,抗氧化能力为(0.56±0.23)mmol/g.结论:新型融合蛋白GSHb FGF有显著的体外促增殖能力及抗氧化活性.     

红景天苷抑制Hcy诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤的实验研究

研究红景天苷(SAL)对同型半胱氨酸(Hcy)诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化应激损伤的保护作用及可能机制.选择3-8代生长状态良好的HUVECs用于实验,采用SAL预孵育HUVECs 2h后,再加入Hcy(1 mmol/L)共孵育12 h诱导内皮细胞氧化应激损伤.采用MTT和LDH法分析细胞损伤,荧光探针法DCFH-DA分析细胞内活性氧(ROS)水平,酶联免疫吸附法分析细胞内丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)的含量,qRT-PCR技术检测Nrf2、HO-1、NQO1的基因表达.结果显示,Hcy显著引起血管内皮细胞损伤,而10、50μmol/L的红景天苷干预给药后,能够提高Hcy诱导的细胞存活率,明显降低LDH、MDA的水平,增加胞内SOD活性.与Hcy处理组相比,SAL干预给药能够降低Hcy所致细胞内ROS的增高,上调Nrf2、抗氧化酶基因HO-1、醌氧化还原酶NQO1的mRNA表达.本研究表明,红景天苷有效抑制Hcy诱导的HUVECs氧化应激损伤,其作用与红景天苷增强细胞清除自由基能力,调控Nrf2信号有关.     

川芎嗪对缺氧缺糖损伤大脑皮层神经元的保护作用及初步机制研究

目的:研究川芎嗪(TMP)对缺氧缺糖(OGD)损伤大脑皮层神经元的保护作用,探讨TMP神经保护作用的可能机制.方法:建立体外原代大脑皮层神经元OGD模型,利用MTT法和LDH试剂盒分别检测细胞存活率及细胞毒性;Hoechst染色法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞内ROS的含量;实时-PCR检测细胞内线粒体生物合成相关mRAN(PGC-1α,TFAM)的表达量.结果:经OGD损伤4 h后,细胞活力明显下降,细胞释放的LDH含量升高;细胞凋亡形态学特征明显,细胞凋亡率增加;细胞内ROS含量增加,同时PGC-1α和TFAM mRNA的表达量明显减少.TMP预保护后,可以明显提高OGD损伤后细胞的存活率,降低LDH的释放,改善细胞核形态变化,并且减少细胞凋亡率,抑制细胞内ROS的产生,提高PGC-1α和TFAM的表达.结论:TMP对OGD损伤的神经元具有神经保护作用,其机制可能与抗氧化,抗凋亡和增加线粒体生物合成相关因子(PGC-1α,TFAM)的表达有关.     

大强度运动对心肌肌钙蛋白I及其降解酶μCalpain的影响

目的:观察急性、慢性大强度运动对血清心肌肌钙蛋白I及其降解酶μCalpain的影响。方法:慢性运动组大鼠每天进行120m in负重8%的游泳训练,每周6d共6周,第6周末进行一次性负重8%的力竭运动,急性运动组饲养到第6周末进行一次性负重8%的力竭运动,安静组常规饲养。各组均24h后取材,检测血清cTnI和心肌组织SOD、CAT活性、MDA含量和μCalpain mRNA表达。结果:急、慢性大强度运动后血清cTnI浓度显著上升,伴随μCalpain mRNA表达增加(P<0.001),血清cTnI与μCalpain存在显著相关性(P<0.001),但两个运动组之间血清cTnI水平、μCalpain mRNA表达没有显著差异,血清cTnI与抗氧化酶SOD活性呈显著负相关性。血清cTnI与MDA含量呈正相关,存在显著相关性(P<0.05)。结论:大强度运动可以导致cTnI降解、抗氧化酶活性下降和过氧化物堆积。大强度运动引起氧化应激反应和μCalpain mRNA表达增加,可能是激活μCalpain引起cTnI降解的原因。     

大强度运动对心肌肌钙蛋白Ⅰ及其降解酶μCalpain的影响

目的:观察急性、慢性大强度运动对血清心肌肌钙蛋白I及其降解酶μCaplpain的影响.方法:慢性运动组大鼠每天进行120min负重8%的游泳训练,每周6d共6周,第6周末进行一次性负重8%的力竭运动,急性运动组饲养到第6周末进行一次性负重8%的力竭运动,安静组常规饲养.各组均24h后取材,检测血清cTnI和心肌组织SOD、CAT活性、MDA含量和μCalpain mRNA表达.结果:急、慢性大强度运动后血清cTnI浓度显著上升,伴随μCalpain mRNA表达增加(P＜0.001),血清cTnI与μCalpain存在显著相关性(P＜0.001),但两个运动组之间血清cTnI水平、μCalpain mRNA表达没有显著差异,血清cTnI与抗氧化酶SOD活性呈显著负相关性.血清cTnI与MDA含量呈正相关,存在显著相关性(P＜0.05).结论:大强度运动可以导致cTnI降解、抗氧化酶活性下降和过氧化物堆积.大强度运动引起氧化应激反应和μCalpain mRNA表达增加,可能是激活μCalpain引起cTnI降解的原因.     

TALENs和CRISPR/Cas9诱导绵羊成纤维细胞基因组定点双链断裂提高Rad51基因表达量

为检测不同限制性人工核酸内切酶对绵羊成纤维细胞Rad51基因m RNA转录和蛋白表达的影响,本实验将有效切割MSTN(myostatin)基因位点的TALENs和CRISPR/Cas9人工核酸酶电转染到体外培养的绵羊成纤维细胞中诱导产生DNA双链定点断裂,与正常和电转染p Max绿色荧光蛋白报告基因质粒的绵羊成纤维细胞进行对照,采用实时荧光定量PCR和Western Blot方法对不同处理的绵羊成纤维细胞Rad51基因m RNA转录和蛋白质的表达情况进行研究。结果表明:TALENs和CRISPA/Cas9人工核酸酶诱导产生的MSTN基因组DNA双链定点断裂能提高绵羊成纤维细胞Rad51基因表达量。