抗人PD-1高亲和力抗血清的制备及其在PD-1免疫印迹分析中的应用

利用纯化的可溶性人PD-1胞外域(sPD-1)蛋白为免疫原免疫小鼠,获得抗血清.免疫印迹显示该抗血清与原核表达的sPD-1有特异性反应,但与某些菌体蛋白存在交叉反应.经菌体蛋白吸附法处理后,交叉反应明显减弱.以商业化抗人PD-1抗体和小鼠sPD-1抗血清分析经亲和层析富集的活化的Jurkat T细胞表达的PD-1,只有自制的抗血清鉴定到特异反应条带,其表观分子质量为49 ku.     

表皮生长因子受体Ⅲ型变异体(EGFRvⅢ) 多克隆抗体的制备及特异性

为了制备针对EGFRvⅢ的特异性多克隆抗体,在实验中利用耦联了血蓝蛋白的EGFRvⅢ特异性的PEP3合成短肽进行动物免疫,制备抗血清;构建了pET30a/E33XI原核表达载体,表达和纯化了融合蛋白His-E33(EGFRvⅢ的部分胞外区);以此融合蛋白作为抗原制备了抗体纯化柱,通过柱上纯化的方法从抗血清中提取针对EGFRvⅢ的特异性抗体.利用U87、U251、HeLa和HEK-293细胞进行免疫组化实验来检验抗体的特异性.     

长型肌球蛋白轻链激酶4Ig结构域的表达及单克隆抗体的制备

长型肌球蛋白轻链激酶(long myosin light chain kinase,L-MLCK)及其分子内结构域的功能还不清楚.在研究其功能时,特异性抗体是一基本工具,但目前国际上还没有制备成功特异性较好的抗体.为此,我们先在大肠杆菌E.coliBL21中重组表达了鸡L-MLCK的4Ig蛋白片段(MLCK4Ig),蛋白经纯化后作为抗原免疫小鼠.在小鼠血清中检测到特异性抗体的基础上,建立了2株杂交瘤细胞株,获得抗鸡MLCK4Ig的单克隆抗体.该抗体可以特异与鸡L-MLCK和鸡MLCK4Ig反应.本文并对该抗体的特性及应用进行了讨论.结果表明,我们部分解决了L-MLCK的抗体缺乏问题,为研究L-MLCK及MLCK4Ig片段的功能提供了重要工具.     

人凝血因子Ⅸ的线性B细胞表位预测及鉴定

为预测并鉴定人凝血因子IX(FIX)的线性B细胞表位.通过IEDB数据库及Discovery Studio软件预测FIX的B表位和白喉毒素T结构域(DTT)的B表位,用所预测的FIX的B表位替换某预测的DTT的B表位形成DTT-表位融合蛋白.通过基因工程技术制备各重组蛋白,并免疫小鼠,通过ELISA和Western-blot检测抗血清效价和特异性,通过等温量热滴定技术(ITC)测定抗体的亲和力.预测到4个FIX的B表位.用重组蛋白FIX-2-DTT免疫的小鼠产生了识别完整FIX的抗体,该抗体具有良好的特异性,其结合常数KD为106 M-1.表明FIX-2(306 NAAINKY312)是FIX的B表位,用重组蛋白FIX-2-DTT免疫小鼠能够产生特异性识别FIX且亲和力温和的抗体.     

中国明对虾ALFFc基因的原核表达与抗血清制备

利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术克隆了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗脂多糖因子(ALFFc)基因的成熟肽编码序列并构建了pET-DsbA-ALFFc原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)筛选法获得了1株高表达量重组菌,并通过实验确定其最佳诱导条件为:菌液初始OD6000.7,IPTG终浓度0.8 mmol/L,培养温度37℃,诱导时间3 h.重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备了抗血清,为进一步研究ALFFc的功能奠定了基础.     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

中国明对虾CrusFc-2基因的重组表达及抗血清制备

利用PCR和DNA重组技术克隆了中国明对虾CrusFc-2基因的成熟肽编码序列并构建了pET-DsbA-CrusFc-2原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到了重组蛋白.重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备了抗血清,Western Blot分析表明Crus...     

基于AhsA蛋白的嗜水气单胞菌特异性抗体的制备与鉴定

选取嗜水气单胞菌表面特异性抗原蛋白AhsA,构建了pET-28a(+)-AhsA表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,利用Ni-NTA亲和层析、凝胶过滤层析等蛋白纯化方法进行纯化。重组蛋白表达效果较好,浓度可达10 mg·mL^-1,纯度可达90%以上,符合制备多克隆抗体的免疫原标准。利用Western Blot技术将AhsA抗体特定识别免疫原蛋白,结果表明该抗体能够特异性识别免疫原蛋白AhsA,而对于牛血清蛋白却不能发生免疫应答,表明该抗体具有一定的特异性且AhsA蛋白具有很好的免疫原性。同时通过检测验证了AhsA蛋白抗体能够特异性检测嗜水气单胞菌,将为水产品质量控制及临床检测嗜水气单胞菌可提供新的技术。     

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

 为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10^-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.     

GFAP单克隆抗体制备及ELISA检测方法研究

制备抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)单克隆抗体,并尝试建立双抗夹心ELISA检测方法,为出血性脑卒中早期诊断提供基础材料.用重组人GFAP作为抗原免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术制备抗GFAP单克隆抗体;用HRP标记单克隆抗体,ELISA和Western blot检测抗体的亚类、表位和特异性;采用ELISA技术制备GFAP检测试剂盒.获得了7株抗GFAP单克隆抗体,抗体亚类为Ig G2或Ig G1,抗体特异性好.抗体配对成功,ELISA检测重组人GFAP灵敏且稳定.