遗传修饰小鼠模型基因型鉴定技术要点介绍

摘要:近年来,随着生物医学研究及基因编辑技术的发展,出现了越来越多的动物模型。 由于制作方法的不同,其基因型鉴定技术方法也不一样,导致基因型鉴定的工作存在混乱无序的现象。 本文根据遗传修饰小鼠模型制作方法进行分类,介绍了随机转基因小鼠、条件性基因敲入小鼠、基因敲除小鼠三类常见模型的基因型鉴定技术要点,规范遗传修饰小鼠模型基因型鉴定方法,保证动物实验材料的准确性,从而推动动物模型在基础和应用科技领域的应用与发展。     

转生长激素基因小鼠、猪、羊的研究进展

自美国科学家Palmiter培育出世界上第一只"超级小鼠"以来,动物育种家们掀起了转基因动物新品种培育的研究热潮.从转基因小鼠到转基因猪和羊,虽然转基因个体的体重都有所增加,但是存在的缺陷也很多,尤其是在生殖方面,使得转基因家畜无法应用到实际当中,更多的是作为疾病模型.本文对转生长激素基因小鼠、猪和羊进行了综述,回顾了超级小鼠、猪和羊研究进展以及存在的问题,并对转基因动物进行了展望.     

辽宁省实验动物转基因重点实验室

中国医科大学辽宁省实验动物转基因重点实验室是由原中国医科大学实验动物部的转基因与基因敲除实验室发展而来的。2003年,中国医科大学在原实验动物转基因实验室基础上成立了辽宁省实验动物转基因与基因敲除平台,2005年被批准为辽宁省实验动物转基因重点实验室,目前该实验室已成为集科研、教学及生产为一体的综合型科研机构,力求为全省的科研和教学服务。“十五”期间,在科研发展及人才培养上加强了与国际上的合作并建立了长期合作关系。目前,已经与美国佛罗里达医学院、日本庆应大学、日本理化研究所、日本仙台大学和北海道大学等建立了友…     

优质早籼不育系HD9802S不育基因tms5的遗传分析及应用研究

tms5是从温敏核不育系安农S-1中鉴定到的不育基因.为验证tms5也是控制不育系HD9802S育性的关键基因,将R287中野生型TMS5基因通过农杆菌介导的转基因方法导入HD9802S中,通过转基因T0代植株育性观察及T1代单株的共分离检测,互补实验从遗传上证明不育系HD9802S不育基因即是tms5.同时本研究通过基因编辑的方法敲除R287中TMS5基因,转基因T0代单株在高温下表现为不育,说明选择合适的受体材料,通过基因编辑技术敲除TMS5基因可以创建新的不育系.     

藏鸡肌肉生长抑制素基因克隆及序列分析

肌肉生长抑制素基因是骨骼肌发育的负性调控因子,本研究利用RT-PCR及T-A克隆技术得到藏鸡myostation编码基因,DNA长1128bp,编码375个氨基酸．本研究克隆的藏鸡MSTN基因,在动物育种、畜牧生产以及治疗肌肉消耗疾病方面具有潜在的应用价值．     

中国自主研发的各类实验动物模型

正中国科学院南京大学-南京生物医药研究院和广州生物医药与健康研究院、广州医药研究总院等合作利用CRISPR/Cas9技术成功培育的两只肌肉生长抑制素(MSTN)基因敲除狗的研究成果,这是在世界上首次建立了狗的基因打靶技术体系。     

“国内外模式动物研究进展”报告会在中检院召开——基因工程技术开创了实验动物开发的新篇章

2013年4月9日,由中国食品药品检定研究院(以下简称中检院)、北京市实验动物行业协会和北京实验动物学学会共同主办的"国内外模式动物研究进展"报告会在中检院召开,大会特别邀请武汉大学心血管病研究所副所长李红良教授作报告,李教授从模式动物的意义、传统的转基因载体构建技术、基因打靶技术、基因敲除动物最新技术、转基因动物的应用等方面介绍了有关转基因动物的研究进展,同时结合自己实验室的工作与大家分享了在转基因技术方面的成果和经验。     

同源重组敲除三角褐指藻基因的研究

为探索应用基因敲除技术研究三角褐指藻基因功能的研究体系,本文以三角褐指藻甘油激酶基因作为靶基因,构建了同源重组基因敲除载体,利用微弹轰击法将该载体成功转化至三角褐指藻中,经100μg/mL Zeocin筛选和PCR验证获得了34个阳性转基因藻株;并进一步对三角褐指藻甘油激酶基因敲除转基因藻株的甘油激酶表达量和生长两方面进行分析,结果显示胞外甘油兼养不影响转基因藻细胞生长,甘油激酶不表达或表达量降低.本文通过构建敲除载体,完成了遗传转化,筛选获得阳性转基因藻,并进一步研究了转基因藻的性状,最终建立了应用同源重组基因敲除技术靶向研究三角褐指藻基因功能的研究体系.     

基因编辑技术在哺乳动物上的研究应用进展

基因编辑技术是近几年兴起的对目标基因组进行高效、定点、精准编辑的技术,主要通过人工核酸内切酶在基因组特定位点进行双链断裂,从而引入DNA片段插入或缺失,实现靶位点的基因敲除、基因定点突变和基因修复等.基因编辑技术被广泛运用在多种动物上,取得了重要成果,前景广阔.文章对基因编辑的发展历程以及在多种哺乳动物上的研究现状和进展进行综述,并对技术瓶颈进行讨论.     

市科技局局长检查指导“陕北白绒山羊基因敲除技术应用”项目

<正>近日,市科技局局长谢军一行赴榆林国家农业科技园区检查指导"陕北白绒山羊基因敲除技术应用"项目,该项目由西北农林科技大学联合榆林学院,在榆林国家农业科技园区陕北白绒山羊良种繁育中心实施,主要敲除了成纤维细胞生长基因(FGF5)和肌肉生长基因(MSTN)。成纤维细胞生长基因(FGF5)是     

家养动物的遗传工程:来自鼠遗传模型报告

本文对从转基因鼠所得到的大量观察进行了报道,以便检验将基因直接导入家养动物的可行性。外源基因的组织特异的或一般的表达已经实现,并且有证据表明它可与内源基因相配合进行活动,这些结果表明参与某些有动物技术价值的特征行为(如食物消化,泌乳,免疫反应)的器官(如肝、乳腺)或组织(如外分泌腺、B淋巴细胞)的活动,通过基因转移得到适当的促进。目前,偶而也能观察到外源基因的异常表达或传递;有时转基因动物的生殖力会严重下降。这些失控行为及至今尚在使用的将基因导人生殖系的低效率方法,对于基因工程在家养动物中的应用仍是一个主要的障碍。     

条件性基因敲除动物及其在毒理学研究领域的应用进展

动物实验是毒理学研究中的重要手段和核心内容。传统的基因敲除动物在胚胎致死性基因研究方面具有一定局限性。条件性基因敲除动物在克服传统基因敲除动物缺陷的情况下,为更深、更广的毒理学研究提供了重要工具。本文将从条件性基因敲除技术的原理及条件性基因敲除动物在毒理学领域中的应用进展两方面来进行综述。     

基于CRISPR/Cas9系统制备猪Pax2基因敲除细胞系

肾脏发育缺陷或缺失的猪模型可为人源化肾脏器官在异种动物体内再生提供“发育空位”,因此敲除肾脏发育关键基因Pax2(Paired box2)获得该动物模型是肾脏再生的关键步骤。本文利用生物信息学分析软件比对分析了不同物种间Pax2蛋白结构，明确了猪Pax2蛋白在氨基酸序列、二级结构和三级结构方面与人、小鼠具有相似性。结合Pax2蛋白在人和小鼠肾脏发育中的功能，选择猪Pax2基因第8外显子序列作为打靶目标区间，设计并构建了用于敲除猪Pax2基因的CRISPR/Cas9打靶载体。在检测CRISPR/Cas9载体打靶猪Pax2基因效率的基础上，利用细胞核转染和G418药物筛选获得巴马小型猪细胞单克隆。通过PCR、T载体克隆和Sanger测序检测各细胞单克隆Pax2基因的敲除情况，鉴定出33个双等位基因敲除Pax2基因的巴马小型猪细胞系，敲除效率达到45.21%(33/73)。本研究为肾脏缺失或肾发育不全的猪模型的获得奠定实验基础，同时为后续在猪体内再造人源化肾脏以及肾发育疾病的研究提供了研究材料。     

基因编辑技术在绒山羊育种中的应用

近年来,随着基因编辑技术发展的日趋完善,其在猪、牛、羊等家畜育种上的应用日益增多.为全面了解基因编辑技术在绒山羊育种中的研究进展,总结了锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活类效应因子(TALENs)和成簇规律间隔短回文重复序列核酸酶(CRISPR/Cas9)三种基因编辑技术的原理和方法,阐述了其在转基因绒山羊研究中的发展现状和应用前景.     

基于CRISPR/Cas9技术构建TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人结直肠腺癌细胞Caco-2中的辣椒素受体基因TRPV1,构建TRPV1基因敲除的Caco-2稳定细胞系.使用CRISPR/Cas9在线靶点设计程序在TRPV1基因4个转录本的公共CDS区的第一个外显子DNA区域中设计一对gRNA,将gRNA构建到真核重组表达质粒的载体上,电转染待敲除细胞,经嘌呤毒素抗性筛选和基因测序获得敲除TRPV1基因的稳定细胞系.用Western Blot检测TRPV1基因蛋白表达量验证Caco-2中TRPV1基因的敲除效果,CCK-8检测TRPV1基因敲除细胞的生长曲线,与野生型细胞对比检测TRPV1基因敲除对细胞生长的影响.筛选出TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,而且TRPV1基因敲除对Caco-2细胞生长无显著影响.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,为后续研究辣椒素对肠道脂类吸收影响的机理研究提供了有利的工具.     

开办"医学实验动物学"本科学历教育的构想

实验动物科学是20世纪50年代新崛起的一门独立的综合性边缘学科，是现代生命科学前沿领域研究中最为活跃的学科门类之一。从20世纪初的近交系动物建立开始，到悉生动物、无菌动物的培育；从单一免疫缺陷动物的发现到复合免疫缺陷等动物模型的建立；从转基因动物的问世到基因敲除动物，     

人工核酸酶介导的基因靶向修饰技术

基因组靶向修饰技术是基因组改造和基因研究的重要手段,而人工核酸酶介导的基因修饰技术很大程度上提高了基因组靶向修饰的有效性、高效性和特异性,其主要工作原理是造成特异性的DNA双链断裂(DSB)诱导细胞内DNA修复,从而造成自发突变或引入人为变化,完成基因的敲入或者敲除.人工核酸酶基因修饰技术,包括了锌指核酸酶(ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术以及CRISPR-Cas系统,它们的分子作用机制、系统构建以及效用有一定的不同.对3种基因修饰技术的原理、研究进展和应用进行系统的阐述.通过利用人工基因修饰技术,能够精确、高效地对特定的基因实现编辑和修饰,以期在基因工程领域得到广泛的应用.     

GmGASA6基因CRISPR-Cas9载体构建及大豆的遗传转化

通过对大豆GmGASA6基因的结构分析,选择了两个靶位点构建了GmGASA6 CRISPR-Cas9的基因编辑载体.利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法进行了遗传转化,共转化外植体800个,获得了转基因阳性苗15株.通过测序证实部分T_1代植株GmGASA6基因的靶位点发生了基因编辑.与野生型相比,种子萌发实验发现突变体的胚根伸长受到显著抑制,说明在种子的萌发过程中GmGASA6基因促进种子萌发和胚根的伸长.     

成都麻羊NSTN基因的克隆测序

根据得克萨斯山羊MSTN基因序列设计引物,并进行PCR扩增,克隆成都麻羊肌肉生成抑制素(MSTN)基因exon1、部分intron1、exon2、部分intron2、exon3及部分intron3,通过DNAman生物软件分析获得MSTN完全编码序列.研究结果,成都麻羊MSTN编码序列含1128个碱基,编码含375个氨基酸的蛋白,编码序列最后三个碱基为终止密码子.exon1全长372bp,翻译第1～124个氨基酸;exon2全长375bp,翻译第125～249个氨基酸;exon3全长381bp,翻译第250～375个氨基酸.成都麻羊MSTN基因exon1变异程度最大,次之为exon2,exon3变异程度最小.     

短小芽孢杆菌遗传操作系统的建立及应用

短小芽孢杆菌SCU11产生的胞外碱性蛋白酶具有良好的生皮脱毛效果,在生物制革领域有很大的应用前景.但该菌株的遗传转化系统尚未建立起来,限制了菌株的遗传改造和基因功能研究等方面的工作.本研究采用高渗透压电转化法,实现了对短小芽孢杆菌的电转化;在Ebuffer配方为甘露醇1M,山梨醇0.5M,甜菜碱7.5%,甘油10%,电场强度24KV/cm条件下,转化效率为3.5×10~3 CFU/μg DNA.构建了E.coli-Bacillus穿梭载体pUCETs,建立了短小芽孢杆菌基因敲除体系,利用该系统成功敲除了基因组中的peptidaseC40基因.本研究所建立的电转化系统及基因导入/敲除体系,为短小芽孢杆菌基因组编辑奠定了基础.