真细菌型的细胞分裂位点决定因子CrMinD基因在衣藻中从叶绿体到核的成功转移

MinD蛋白是一种普遍存在的ATP酶, 在真细菌、古细菌以及植物叶绿体的分裂过程中发挥着关键的作用. 在已研究过的4种绿藻(Mesostigma viride, Nephroselmis olivacea, Chlorella vulgaris, Prototheca wicker-hamii)中, MinD基因均由叶绿体基因组编码. 但在拟南芥中, MinD基因由核基因组编码, 其蛋白定位于叶绿体并参与叶绿体分裂的调控, 说明在高等陆生植物中, MinD基因已经转移到核基因组. 然而, 对于在质体进化过程中MinD基因从叶绿体转移至核的机制还不清楚. 我们从单细胞绿藻(Chlamydomonas reinhardtii, 衣藻)中鉴定了一个核编码的MinD同源物CrMinD, 其在野生型大肠杆菌(E. coli)中的过表达会抑制细胞的分裂并导致丝状细胞的形成, 表明植物MinD蛋白在进化上的保守性. CrMinD-egfp在烟草和拟南芥中的瞬时表达确认了CrMinD蛋白在调节叶绿体分裂中的作用. 在已公布的所有陆生植物质体基因组序列中, 没有发现MinD的同源物, 说明MinD基因从质体转移至核这一事件在进化出陆生植物以前就已经发生了.     

高粱叶绿体psbD基因的克隆及其高效表达

近年来光合作用基因工程的研究进展十分迅速,许多重要的编码光合作用反应中心的蛋白质及酶的基因,已在多种植物叶绿体基因组及核基因组上定位并测定了其碱基序列,杉浦昌弘等先后完成了烟草、水稻等高等植物叶绿体基因组全序列分析,但是C_4植物除玉米外,叶绿体基因的研究较少,高粱是主要的C_4植物,其叶绿体光系统基因的研究国内外均     

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草.Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高.以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

TNV-AC亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate, TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录. 在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明, TNV-A^C亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G²¹⁸⁴, 亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G²⁴⁶⁰. 进一步分析表明, 亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失, 但不影响病毒在烟草原生质体中的复制, 说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动, 是病毒造成枯斑所必需的基因. 通过原核表达产物分析, 证明了亚基因组RNA2 中外壳蛋白(coat protein, CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG. CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明, 完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的, 但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响. 综合以上结果, 对 TNV-A^C的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

通过叶绿体基因工程在烟草中合成中长链羟基脂肪酸聚酯

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs)属于微生物聚酯. PHA合酶(PHA synthase, 由phaC基因编码)和3-羟酰基-酰基转移蛋白-辅酶A转移酶(3-hydroxyacyl-acyl carrier protein-coenzyme A transferase, 由phaG基因编码)是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶. 以aadA(氨基糖苷-3′-磷酸转移酶)基因做筛选标记, 分别构建了含phaC2基因的单价叶绿体转化表达载体pTC2以及同时嵌合phaC和phaG基因的双价叶绿体转化表达载体pTGC. 通过PDS1000/He基因枪转化法转化烟草, 获得具有壮观霉素抗性的叶绿体型转基因烟草植株, PCR和Southern Blot结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中且基本达到同质化. 气相色谱法检测转基因株系中的mcl-PHAs含量最高达4.8 mg/g干重, 合成的PHAs单体主要成分为3-羟基辛酸(3-hydroxyoctanoate, 3-HO)和3-羟基癸酸(3-dydroxydecanoate, 3-HD). 透射电子显微镜观察到转基因烟草叶片叶绿体中确有PHAs颗粒累积.     

nifH基因能够在高等植物叶绿体原核环境中表达

以高等模式植物烟草为材料，对固氮酶铁蛋白基因nifH在叶绿体中的表达进行了研究。构建了nifH基因叶绿体转化载体，并利用基因轰击法对烟草叶片进行了转化。基因枪轰击后，共获得6株壮观霉素抗性再生植株。PCR检测及Southern杂交鉴定结果表明，aadA和nifH等外源基因已整合进入受体植物叶绿体基因组中；Western免疫学淀法的测定结果则证明，nifH基因能够在叶绿体原核环境中表达。     

TNV-A~C亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录.在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明,TNV-AC亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G2184,亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G2460.进一步分析表明,亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失,但不影响病毒在烟草原生质体中的复制,说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动,是病毒造成枯斑所必需的基因.通过原核表达产物分析,证明了亚基因组RNA2中外壳蛋白(coat protein,CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG.CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明,完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的,但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响.综合以上结果,对TNV-AC的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

通过叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因

构建了含phbB, phbA, phbC和aadA基因表达盒的叶绿体整合及表达载体, 通过基因枪轰击法转化烟草. 对具壮观霉素抗性的植株进行PCR和Southern等分析, 确证外源基因已整合到叶绿体基因组中, 同时测定了其同质化程度. Northern点杂交、RT-PCR分析结果表明, 叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因, 并且未观察到基因沉默现象. 叶绿体型转基因植株还具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点, 表明叶绿体基因工程在转基因植物生产聚3-羟基丁酸酯(PHB)方面极具潜力.     

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae) cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段). 以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库, 采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana), 从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆. 对上述阳性克隆进行序列测定和分析, 结果显示, 其中7个与已知的基因具有较高的同源性, 其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白; PBC163编码一个Rab蛋白, 与大豆疫霉的RAB同源性较高; PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin); PBN62编码一个热激蛋白60 (HSP60). 还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因, 提示可能是该病原菌特异的激发子基因. 上述结果表明, 利用病毒表达载体构建cDNA文库, 用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因, 该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.     

通过叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯

构建了含phbB,phbA,phbC和ααdA基因表达盒的叶绿体整合及表达载体，通过基因枪轰击法转化烟草，对具壮观霉素抗性的植株进行PCR和Southern等分析，确证外源基因已整合到叶绿体基因组中，同时测定了其同质化程度。Northern点杂交、RT－PCR分析结果表明，叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因，并且未观察到基因沉默现象，叶绿体型转基因植株还具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点，表明叶绿体基因工程在转基因植物生产聚－3－羟基本丁酸酯(PHB）方面极具潜力。     

又一个例证——SV40 DNA的全核苷酸顺序

病毒SV40以及多瘤病毒作为直核细胞基因结构和表达的模型已被深入研究。 SV40 DNA是一个超螺旋的、环状的双链DNA,它的全核苷酸顺序(5224个碱基对)已发表。全顺序的测出,能够在基因组上确定已知基因的位置。基因组中至少有15.2％是不翻译成多肽的。全顺序可分为早转录区和晚转录区两大区段。早转录区编码两个蛋白质——t抗原和T抗原,二者的基因起始于同一位置,并共用一段约300个碱基对长的片     

烟草花叶病毒及番茄花叶病毒弱毒疫苗N14基因组重组体的构建与侵染性分析

用基因交换的方法将烟草花叶病毒普通株（中国分离物，ＴＭＶ－Ｃｖ）和番茄花叶病毒弱毒疫苗Ｎ１４基因组的运动蛋白（ＭＰ）、外壳蛋白（ＣＰ）基因编码区和３’非编码区嵌合于Ｎ１４和ＴＭＶ－Ｃｖ５’非编码区和复制酶原下游，构建重组病毒克隆ＰＴＮＴ和ＰＮＴ，并进行体外转录和烟草染试验。结果ｐＴＮ和ｐＮＴ体外转录物对烟草均具侵染性：前者感染枯斑三生烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔｏｂａｃｕｍｃｖ．ＳａｍｓｕｎＮＮ），等     

果蝇3个新的小分子非编码RNA的鉴定

通过比较基因组和分子生物学方法分析了果蝇属中5种果蝇全基因组内含子区域的保守序列, 获得了3个新的非编码RNA基因. 其中一个为具有典型的box C/D家族保守元件及结构特征的核仁小分子RNA基因, 其功能序列可介导28S rRNA的C2673位点的核糖甲基化修饰. 另外两个为miRNA基因, 其转录序列可形成典型的miRNA前体茎环结构; 在果蝇发育的4个时期均可表达产生长度为23个核苷酸的成熟RNA分子. 结果还表明, 在长度为100~500 bp区间的黑腹果蝇基因内含子中存在396个多物种保守序列(MCIS), 这些序列除编码小分子RNA外, 还可能与影响基因转录或转录后加工的顺式元件有关.     

“垃圾”DNA的奥秘

依据DNA双螺旋和遗传信息的中心法则,只有编码蛋白的DNA才被认为是有功能的.然而人类基因组大小与蛋白质数量矛盾以及生物体进化与基因组大小的不相关性(即C值悖论),导致科学家对非编码DNA概念的提出,戏称这些DNA为"垃圾"DNA.随着第二代测序技术发展以及数据分析能力的提升,大量研究表明,这些"垃圾"DNA很多都可以在生理与疾病状态下特异性转录.同时,疾病全基因组相关联研究显示,大量与疾病相关单核苷酸多态性位点位于非编码区,这共同证明了它们是有功能的.进一步研究表明,人类基因组中至少75%的序列是转录的,并将这些转录且不编码蛋白质的产物称为非编码RNA.本研究组系统总结了3大类非编码RNA包括微小RNA、长链非编码RNA和环状RNA的定义和分类以及在疾病中的功能,对这些的非编码RNA的研究将会为疾病的治疗以及诊断方法开启新纪元.     

人可溶性TRAIL蛋白在衣藻叶绿体中的表达

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性. 以衣藻叶绿体基因组的clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2为同源重组片段, 壮观霉素抗性基因为选择标记, 构建了编码TRAIL胞外区可溶性片段(sTRAIL)的cDNA衣藻叶绿体表达载体p64TRAIL, 通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中, 经壮观霉素抗性筛选, 获得了3个抗性衣藻转化子. 转化子经过抗性继代筛选后, 经PCR, Southern blot检测分析及暗培养, 证实sTRAIL编码区DNA已整合到衣藻叶绿体基因组中, Western blot检测分析表明, sTRAIL编码区在衣藻叶绿体中获得了表达. Western blot影像摄录分析表明, 表达的sTRAIL蛋白占衣藻细胞可溶性总蛋白的0.43%~0.67%. 实验结果证明, 用衣藻叶绿体作为生物反应器生产医药蛋白是可行的.     

水稻条纹叶枯病毒基因组含vRNA_2 ORF片段的克隆、序列分析及其在原核中的表达

水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus,RSV)是柔丝病毒组的典型代表,其基因组由4种ss-RNA及相应低含量的4种dsRNA组成,其中,RNA1为负链性质,编码RNA多聚酶;RNA2～4均为双义编码性质(ambisense-coding strategy)。为研究该病毒RNA非编码区等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能,采用反转录-聚合酶链式反应方法(RT-PCR),扩增出覆盖RSV RNA2 5′末端非编码区、vRNA2OrFT区、基因间非编码区及vcRNA2 ORF部分区域的REPI片段(1 159bp)。将此扩增产物克隆于载体pGEM-7Zf( )的Sma Ⅰ位点上并进行了核苷酸序列测定。结果表明,中国分离物与日本分离物的REPI片段具极高的序列同源性。将REPI片段克隆到原核高效表达载体pJW2的P_RP_L启动子下游,经温度诱导,获得了高效     

粟酒裂殖酵母一个新的box C/D snoRNA的鉴定、功能分析及进化意义

通过筛选粟酒裂殖酵母核内小分子RNA的cDNA文库，获得了一个新的小分子RNA序列。该RNA具有典型的box C/D snoRNA的保守元件和结构特征，并具有一段与25S rRNA互补的、长度为10个核苷酸的反义序列，推测其可指导25S rRNA G940 位点2’-O-核糖甲基化修饰。经dNTP浓度依赖性引物延伸实验验证，G940确实为2’-O-核糖甲基化修饰位点。功能元件比较分析揭示该snoRNA的上游反义序列与酿酒酵母snR60 的下游反义序列同源，故命名为snR60-Ⅱ。snR60-Ⅱ基因位于一个非编码RNA基因的内含子中，其产物由宿主基因转录后的RNA前体加工而来。这是酵母snoRNA由非编码RNA基因内含子编码的首次报道。通过计算机分析，本研究还从真菌和果蝇中分别发现了一批酵母snR60功能同源分子。在不同生物中，snR60存在独立基因编码、内含子编码和多顺反子转录等多种基因组织形式，表明snR60在进化过程中具有高度的移动性。     

两种植物病毒编码蛋白的基因沉默抑制子功能鉴定

采用农杆菌浸润方法以及重组的马铃薯X病毒(PVX)表达载体, 研究了甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)编码的P14蛋白和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)编码的S6蛋白对植物基因沉默的抑制作用. 绿色荧光蛋白(GFP)表型观察及核酸杂交结果表明, 这2种病毒基因均能够强烈抑制转基因本生烟(16C)中由同源序列引起的gfp基因沉默, gfp基因mRNA的含量明显高于未发生沉默抑制的对照植株, 并导致PVX感染后的寄主症状加重, 说明它们可能是由病毒编码的RNA沉默抑制因子. 其中, RBSDV S6基因对植株体内基因组DNA甲基化过程的抑制作用更为强烈.     

抑制COMT与CCoAOMT调控植物木质素的生物合成

咖啡酸-3-O-甲基转移酶（COMT）与咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶（CCoAOMT）基因分别编码植物木质素生物合成中不同底物水平的甲基化酶,构建了它们的单价与双价反义表达载体,并用农杆茵介导转化烟草.PCR-Southern检测表明外源基因已整合到烟草基因组DNA中;Northern点杂交结果表明外源基因在烟草中以转录水平表达.对表达单个及两个甲基化酶反义基因的成熟转基因植株的木质素含量测定结果表明,反义抑制COMT与CCoAOMT的表达均使转基因植株的木质素含量下降,但单独抑制CCoAOMT表达引起的下降幅度明显大于COMT,并且两个基因同时被抑制时,降低幅度更大,说明它们具有协同效应.组织化学染色结果说明COMT被抑制引起紫丁香基（S）木质素显著减少.上述结果表明,抑制植物内源CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成及改良造纸资源植物的有效途径.     

rps12基因在裸子植物中的分子进化式样

叶绿体rps12基因是所有叶绿体基因中最特殊的,由在基因组上相距甚远的两部分组成,含有3个外显子,经反式剪接作用编码核糖体小亚基S12蛋白.探究该基因的分子进化式样有助于理解该基因的进化过程及基因组特征.应用二代测序技术对南洋杉和柏木的叶绿体基因组进行测序;共选取78种裸子植物和2种蕨类植物,在系统发育背景下结合最大似然法,对rps12基因的进化速率、选择压力和适应性进化进行分析.结果显示,外显子3发生独立的碱基插入事件,发生插入的序列受到了更强的负选择作用;外显子2～3位于反向重复区,它们的替换率显著低于外显子1, rps12编码序列受到更强的负选择作用;适应性进化分析没有检测到正选择位点.结果表明,在裸子植物的进化过程中rps12基因结构稳定,并保持着相对较低的进化速率且表现出高度的保守特性;这为反向重复区具有降低的替换率提供了更多的证据,同时也揭示了裸子植物中存在的进化速率异质性现象.