衣藻肌动蛋白-绿色荧光蛋白的融合基因在烟草悬浮细胞中的表达及融合蛋白的体外聚合

将衣灌（Chlamydomonas reinhardtii)肌动蛋白（actin）基因(cDNA)与绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP)基因融合后,分别构建到原核和植物表达载体中,并在BL21plus细菌和烟草悬浮细胞（BY-2）中进行表达。通过荧光显微镜观测到重组后的融合蛋白在菌体和烟草悬浮细胞中得到正确表达。肌动蛋白-绿色荧光蛋白 的融合蛋白主要分布在烟草悬浮细胞细胞膜周围,参与膜骨架的组成,另外还大量分布于细胞核周围和细胞板的位置,同时也在细胞内形成丝状结构,参与F-actin的组成。将肌动蛋白-绿色荧光蛋白融合基因的原核表达产物经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和疏水柱层析后,得以纯化,并在纯化产物中加入肌动蛋白聚合缓冲液,纯化的肌动蛋白能聚合成为丝状结构即F-actin,这表明低等藻类的肌动蛋白具有同高等植物和动物相似的性质和功能。     

成蛋白: 一种新的细胞微丝骨架组装的调控因子

微丝骨架是真核细胞骨架的重要组成成分, 其动态结构在时空上受一系列肌动蛋白结合蛋白的调节. 近年来, 在众多的肌动蛋白结合蛋白中, 成蛋白(formin)家族蛋白受到了更多的关注, 因为它们可以利用细胞内普遍存在的、与前纤维蛋白结合的肌动蛋白库形成不分支的微丝骨架结构. 目前, 来源于不同生物的成蛋白家族成员已经得到大量报道, 对它们特性的认识亦愈加明确, 但是有一些问题尚待阐明. 本文综述了近年来关于成蛋白家族蛋白在结构、功能和成核机理方面的研究进展, 并且比较了该家族不同成员的理化特性, 以期为成蛋白的进一步深入研究提供更清晰的线索.     

玉米花粉中凝溶胶蛋白的免疫化学鉴定

肌动蛋白广泛存在于各种真核细胞中,参与细胞内多种运动过程。在正常生理条件下,肌动蛋白以两种形式存在:单体（G-actin）及聚合体（F-actin）,两者在细胞内通过聚合解聚作用维持动态平衡。F-肌动蛋白为双股螺旋丝,它能进一步形成更有序的微丝束或网状结构,以维持细胞正常生命活动所需的空间结构和胞内物质的定向运动。细胞能在特定的时间、空间调节肌动蛋白的聚合解聚过程,能与肌动蛋白结合并调节其聚合解聚作用的一类蛋白统称为肌动蛋白结合蛋白（Actin-binding proteins,简称ABPs）,目前生物界已发现了几十种ABP。凝溶胶蛋白（Gelsolin）是研究较为清楚的一种ABP,最早Yin和Stossel于1979年从兔肺巨噬细胞提取液中分离得到,以后证明它普遍存在于低等的真核生物到高等哺乳动物中,依其来源可分     

Ras类原癌基因产物Ran GTPase在细胞增殖调控中的作用

Ran是一种大量分布于细胞核内的GTP酶, 是Ras类原癌基因大家族中的一员. Ran的功能多种多样, 有许多证据表明Ran及其结合蛋白参与调控细胞周期中的多个过程. 目前比较确认的功能主要包括: 通过调节核质物质转运而调控细胞周期调控因子的定位、调控核膜装配、调控DNA复制、调控纺锤体组装等. 此外, 还有资料显示Ran参与细胞核结构的维持、mRNA转录和剪接、RNA由核内向胞质中转运等. 本文主要对Ran调控核膜装配、DNA复制、纺锤体组装等机理进行评述.     

Nelin的肌动蛋白结合特性及与其相互作用蛋白质的筛选

为了研究人新基因nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的生物特性, 并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质, 对Nelin蛋白的全长及其部分结构域进行了肌动蛋白结合共沉淀实验, 并在真核细胞内进行了免疫荧光共定位实验. 结果发现, 在体外共沉淀和细胞内共定位实验中Nelin均表现出同肌动蛋白相结合的能力. 进一步采用酵母双杂交的方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选, 得到了3个阳性克隆分别为细丝蛋白(Filamin)C亚型、肌联蛋白(Titin)N2B亚型和α胰蛋白酶抑制物重链前体 (ITIH). 通过免疫共沉淀实验, 验证了Nelin能够同Filamin的羧基末端免疫球蛋白样结构发生相互作用. 通过上述实验证明了Nelin为一个新的肌动蛋白结合蛋白, 并且能够同Filamin相结合. 由此推论新基因nelin的心肌表达产物Nelin是一个细胞骨架相关蛋白并且很可能作为一个膜-细胞骨架连接蛋白, 起到了参与细胞黏着斑形成的过程.     

植物远红光受体——光敏色素A的研究进展

光敏色素是植物中感受红光和远红光的光受体,而光敏色素A(phyA)是植物中唯一感受并响应远红光信号的光受体。phyA以Pr形式在细胞质中合成,接受光照后被激活,转换为具有生物活性的Pfr形式。Pfr形式的phyA与穿梭蛋白FHY1/FHL结合并被转运进入细胞核,在细胞核中与FHY1/FHL分离;FHY1/FHL出核,进行下一个转运phyA进入细胞核的循环。近年发展的phyA数学模型指出,phyA受体Pr与Pfr形式间的转换,以及特异性依赖FHY1/FHL转运进入细胞核,决定其成为植物远红光的光受体。在细胞核中,激活形式的phyA与COP1和SPA蛋白直接相互作用,抑制其形成有功能的E3泛素连接酶复合体;从而使转录因子HY5等蛋白能够积累,促进光形态建成的发生。Pfr形式的phyA也可以与转录因子PIFs相互作用,并介导PIFs的快速磷酸化和降解,从而解除PIFs对光形态建成的抑制作用。FHY3和FAR1是转座酶衍生的一类转录因子,能够在远红光下直接激活FHY1/FHL的基因表达;而HY5能够负反馈调控FHY3/FAR1对于FHY1/FHL的转录激活作用,从而维持远红光信号的动态平衡。Pfr形式的phyA在细胞核内能够被磷酸化,磷酸化的phyA是COP1/SPA的E3泛素连接酶复合体优先降解的底物;而最新的研究表明,磷酸化的phyA可能是一种活性更强的形式,在诱导植物远红光信号响应中扮演重要的角色。     

植物远红光受体——光敏色素A的研究进展#br#

光敏色素是植物中感受红光和远红光的光受体，而光敏色素A(phyA)是植物中唯一感受并响应远红光信号的光受体。phyA以Pr形式在细胞质中合成，接受光照后被激活，转换为具有生物活性的Pfr形式。Pfr形式的phyA与穿梭蛋白FHY1/FHL结合并被转运进入细胞核，在细胞核中与FHY1/FHL分离；FHY1/FHL出核，进行下一个转运phyA进入细胞核的循环。近年发展的phyA数学模型指出，phyA受体Pr与Pfr形式间的转换，以及特异性依赖FHY1/FHL转运进入细胞核，决定其成为植物远红光的光受体。在细胞核中，激活形式的phyA与COP1和SPA蛋白直接相互作用，抑制其形成有功能的E3泛素连接酶复合体；从而使转录因子HY5等蛋白能够积累，促进光形态建成的发生。Pfr形式的phyA也可以与转录因子PIFs相互作用，并介导PIFs的快速磷酸化和降解，从而解除PIFs对光形态建成的抑制作用。FHY3和FAR1是转座酶衍生的一类转录因子，能够在远红光下直接激活FHY1/FHL的基因表达；而HY5能够负反馈调控FHY3/FAR1对于FHY1/FHL的转录激活作用，从而维持远红光信号的动态平衡。Pfr形式的phyA在细胞核内能够被磷酸化，磷酸化的phyA是COP1/SPA的E3泛素连接酶复合体优先降解的底物；而最新的研究表明，磷酸化的phyA可能是一种活性更强的形式，在诱导植物远红光信号响应中扮演重要的角色。     

Nelin的肌动蛋白结合特性及与其相互作用

为了研究人新基因nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的生物特性, 并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质, 对Nelin蛋白的全长及其部分结构域进行了肌动蛋白结合共沉淀实验, 并在真核细胞内进行了免疫荧光共定位实验. 结果发现, 在体外共沉淀和细胞内共定位实验中Nelin均表现出同肌动蛋白相结合的能力. 进一步采用酵母双杂交的方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选, 得到了3个阳性克隆分别为细丝蛋白(Filamin)C亚型、肌联蛋白(Titin)N2B亚型和a胰蛋白酶抑制物重链前体 (ITIH). 通过免疫共沉淀实验, 验证了Nelin能够同Filamin的羧基末端免疫球蛋白样结构发生相互作用. 通过上述实验证明了Nelin为一个新的肌动蛋白结合蛋白, 并且能够同Filamin相结合. 由此推论新基因nelin的心肌表达产物Nelin是一个细胞骨架相关蛋白并且很可能作为一个膜-细胞骨架连接蛋白, 起到了参与细胞黏着斑形成的过程.     

神经再生过程中脊髓运动神经元β和γ肌动蛋白的基因表达

神经细胞的特点之一是轴突缺乏合成蛋白的能力,轴突生长发育、代谢更新以及损伤后再生中所需的结构和功能物质必须在神经元胞体内合成,经轴浆转运供应.细胞骨架是轴突构筑的重要组分,其主要组分之一的微管又是转运物质的载体.我们曾经报道再生神经中微管亚基管蛋白的含量和转运速度以及腹角运动神经元中管蛋白mRNA的含量均明显增高,从而满足轴突构筑重建的需要.由于作为细胞骨架的微丝其亚基肌动蛋白的含量在再生神经中也有增加,而肌动蛋白又可能有转运轴浆中小泡的功能,但尚未见再生过程中脊     

豌豆肌动蛋白异型体(PEAc1)与绿色荧光蛋白融合基因的原核表达与特性分析

肌动蛋白普遍存在于真核生物细胞中, 并在细胞生命活动中发挥重要作用. 在细胞中, 肌动蛋白多以异型体(isoform)形式存在. 植物肌动蛋白异型体的大量获得和理化特性分析一直是一个难题. 对豌豆肌动蛋白异型体PEAc1与组氨酸标签(His-tag)、绿色荧光蛋白(GFP)进行了基因融合和原核表达. 通过脲变性、梯度脲透析复性、镍柱亲和层析的方法从包涵体中纯化出大量、高纯度的PEAc1-GFP融合蛋白(> 2 mg/L培养物). 理化特性分析表明, 它同鸡骨骼肌肌动蛋白一样, 单体PEAc1-GFP能与DNaseⅠ结合并显著抑制后者酶活性; 单体PEAc1-GFP能聚合成带有绿色荧光的丝状结构; 聚合的PEAc1- GFP能被微丝的特异标记物鬼笔环肽(phalloidin)标记; PEAc1-GFP与鸡骨骼肌肌动蛋白的聚合曲线趋势基本一致, 聚合临界浓度为0.24 μmol/L; 聚合的PEAc1-GFP能激活肌球蛋白Mg-ATPase活性, 其激活比率随浓度的增加而增加, 在1 mg/mL浓度下, 能激活4倍以上. 上述结果表明, 带有组氨酸标签和GFP标记的PEAc1表现出和天然肌动蛋白相似的理化特性; 基因融合、原核表达、变性、复性及亲和纯化是获得大量高纯度植物肌动蛋白异型体的有效方法.     

转移消失蛋白研究进展

转移消失蛋白(missing in metastasis,MIM)是一种重要的胞内膜调控蛋白,属于inverse BAR(I-BAR)家族成员,能结合细胞膜并在细胞极化、运动和内吞作用等过程中发挥调节功能,其表达异常与多种疾病尤其是肿瘤发生或转移相关,在神经系统、循环系统和生殖泌尿系统中也有一定作用.MIM蛋白的生物学功能包括调节肌动蛋白细胞骨架、与皮动蛋白等其他蛋白相互作用、参与细胞信号通路调控、改变细胞膜形态并促进细胞极化等,在结构上表现出典型I-BAR家族成员特征,借助其N端的I-BAR区域自聚合形成二聚体,促使细胞膜形成伪足状突起,甚至可以调控人造磷脂囊泡,但二聚体的形成也可被靶向的多肽等抑制剂阻断.除作用于蛋白I-BAR,RPTP结合域的特异性多肽外,MIM也可被RNAi干涉,在肿瘤生物治疗领域具有开发潜力.本文回顾了MIM蛋白相关医学研究进展,综述了MIM蛋白已知的生物功能,分析了MIM蛋白靶向治疗及其他应用前景,并提出了可能的研究新方向、新思路.     

电针刺激大鼠脑内c-fos原癌基因表达加速

原癌基因c-fos的表达产物Fos蛋白是细胞核内的磷酸蛋白,它可同DNA结合生成DNA结合蛋白复合物。现已知多种刺激可引起c-fos基因和Fos蛋白在中枢神经系统的相关核团内表达。许多研究者认为,Fos蛋白可能作为一种核内“第三信使”分子,通过调节特异靶基因的表达而把细胞外刺激和长时程的细胞功能改变联系起来。本工作应用转移电泳吸印(northern blot)杂交和免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)的方法观察了电针刺激对原癌基因c-fos表达的影响。     

体外组装的细胞核中的核骨架

细胞核组装(nuclear assembly)普遍存在于真核细胞生命过程中,如有丝分裂和减数分裂完成后细胞核的重组装,是研究细胞核构建与功能的良好模型.但生物体乃至单个细胞是相当复杂的系统,各种因素错综复杂,相互作用,不易操作、控制和分析,细胞核体外组装系统(cell free nuclear assembly system)的建立提供了一个很好的实验模式.核骨架(nuclear matrix)是细胞核内以纤维蛋白成分为主的纤维网架结构,大量研究     

细胞核迁移相关蛋白的研究进展

细胞核迁移是一种细胞核向细胞中特定位点移动的非随机现象, 对于生长、分裂以及发育等正常细胞活动至关重要. 大量研究表明, 这一过程涉及细胞骨架、分子马达和其他相关蛋白. 虽然在高等生物尤其是高等植物中的研究才刚刚起步,但是在酵母和丝状真菌中对于这些相关蛋白的研究已经很深入.     

核基质和染色体骨架与端粒DNA和c-Ras基因关系的研究

核基质(Nuclear matrix)是存在于真核细胞核内的以蛋白成分为主的水不溶性纤维网络体系.近年来的广泛研究表明该体系不仅是维持细胞核形态的支架,而且在DNA复制、基因表达的调节、核内激素的结合等方面起着十分重要的作用.染色体骨架(Chromosome scaf-fold)是中期染色体中去除DNA与组蛋白后得到的由非组蛋白构成的支架结构.有资料表明染色体骨架可能来自于核基质:Bakers等人对粘菌(Physarum polycephalum)有丝分裂周     

金属转运蛋白SLC39A14的代谢性功能研究进展

微量元素是维持人体生理和代谢功能的重要的营养素之一,既可参与人体生理生化功能调控,亦可作为生物大分子的组成或辅助成分,如激素和维生素有机组成.微量元素对维持机体正常生命活动具有重要意义.其中,必需微量元素是机体内不能产生或合成但又是维持生物体正常生理机能不可或缺的,如铁、锰、锌等,主要通过消化道中不同的金属转运蛋白(metal transporter)转运吸收.近年来,随着金属转运蛋白不断被鉴定与发现以及金属转运蛋白的功能研究进展,认为SLC39A14在不同组织中参与铁、锌、锰等必需微量元素转运,并且参与多种生物学功能.基于目前对金属转运蛋白在代谢性器官以及代谢性疾病中的作用机理的了解和认识,本文回顾性总结了金属转运蛋白SLC39A14在不同代谢组织器官的代谢性功能和作用机制.     

铁离子对肌动蛋白聚合的影响

肌动蛋白(Actin)是细胞骨架蛋白之一.在一定的条件下其球状单体(G-actin)可以聚合为丝状聚合体(F-actin).细胞的形态学变化及游动性与此特性有关.已经证明一些金属离子(如K~+,Mg~(2+),Ca~(2+))在ATP存在下可引发肌动蛋白的聚合.我们曾报告Fe(Ⅱ)离子可引起体外培养的软骨细胞形态发生明显变化,并伴有细胞功能的变化.用鬼笔环肽标记方法观察到Fe(Ⅱ)作用于细胞骨架,使细胞骨架微丝系统发生了解组与重组.为了进一步研究Fe(Ⅱ)离子与细胞微丝的相互作用,探讨软骨细胞形态与功能之间的关系.本文利用从兔腿肌肉分离纯化的肌动蛋白,研究了Fe(Ⅱ)离子对肌动蛋白聚合过程的影响.1材料和方法1.1试剂三磷酸腺苷(ATP)购自Sigma公司,叠氨化钠(N_aN_3)和三羟甲基氨基甲烷(Tris)为进口分装试剂;其余均为国产分析纯试剂.1.2肌动蛋白的分离与纯化参照文献[4]方法由兔腿肌肉分离提取丙酮干粉(-15℃可保存数月).取一定量丙酮干粉经离心、盐析及透析等步骤分离并纯化得G-actin.G-actin溶解在缓冲溶液G(2mmol/LTris-HCI,0.2mmol/L ATP,0.5mmol/L二巯基乙醇,1.5mmol/L NaN_3,pH=8.0)中在4℃下放置两周无明显聚合.由紫外分光光度法(A_(290))确定G-actin含量.     

从花粉肌动蛋白到作物雄性不育

肌动蛋白在动植物细胞的生命活动中担负着重要任务. 花粉细胞中含有丰富的肌动蛋白,其结构及性质与动物肌动蛋白极其相似. 植物肌动蛋白基因的碱基序列及氨基酸序列与动物的序列亦极为相似. 植物细胞质雄性不育系植株的花粉比其保持系花粉中的肌动蛋白含量低得多. 在植物发育过程中肌动蛋白基因的表达有明显的器官特异性,在花粉中的表达量比根、茎、叶中高得多. 构建了肌动蛋白反义基因的表达质粒,转移到小麦和番茄原生质体中,以抑制花粉中肌动蛋白基因的表达,从而获得雄性不育植株. 转基因植株花粉中的肌动蛋白明显减少,而雌芯却不受影响. 此项研究为培育作物雄性不育系开辟了新途径.     

导致心脏猝死的基因缺陷

一种在剧烈运动时导致猝死的心脏遗传缺陷病现在已可通过验血而得到鉴定。这种遗传缺陷病称为肥大性心肌病,其结果是心肌增厚。这是年轻人,特别是运动员发生突然性心脏死亡的最常见病因。这种遗传突变发生在第14染色体的肌球蛋白基因上。肌球蛋白是组成心肌的两种主要蛋白之一,是人体肌肉中最丰富的蛋白。它同肌动蛋白一起,负责着肌肉的收缩和放松。美国休斯敦贝勒医学院的阿利·马利安说:“肌球蛋白是一种同其他蛋白相互作用的复杂蛋白。”他认为这种遗传缺陷可以改变肌球蛋白的导电性质,从而改变它的功能并影响它与肌动蛋白相互作用的方     

磷酸化修饰动态调控流感病毒复制

磷酸化是一种常见的蛋白质翻译后修饰形式,调控蛋白质的活性、稳定性、细胞内定位和蛋白质互作等功能.在真核细胞中,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是最常见的磷酸化位点.在流感病毒复制的生命周期中,病毒蛋白可被宿主激酶磷酸化修饰,并调节其核质穿梭、信号转导等功能,从而调控病毒的生长、复制和致病力.本文就近年来关于流感病毒内部核蛋白、基质蛋白1、非结构蛋白1的磷酸化修饰位点和其生物学功能进行综述,为深入了解流感病毒复制周期及抗病毒药物研发提供理论基础.