阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析

为研究具有广谱拮抗活性的阴沟肠杆菌B8的拮抗机理, 应用自杀性质粒pZJ25, 将Tn5转座到B8的染色体上, 筛选到2株拮抗活性丧失的菌株. 选择其中B8F突变株, 应用Tn5上的Kan^r基因作为标签, 对Tn5插入位点右侧的拮抗活性相关基因片段进行了克隆, 筛选得到质粒pTLF, 经亚克隆后测序, 获得F片段735 bp的序列. 提取原始菌株B8基因组DNA, 酶切后与PstⅠ接头连接, 应用接头引物和根据F片段设计的特异引物, 在F片段的左右两侧进行染色体步行, 获得了F片段(Tn5插入位点)左侧的1106 bp序列和F片段右侧的664 bp序列. 生物信息学分析显示, 获得的B8菌株拮抗相关基因序列包含3个ORF, 与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(基因GenBank登录号AY192157)有较高的同源性, 分别对应于admM, admN和admO共3个基因. 被Tn5插入破坏的ORF(命名为anrF基因)对应于admM (Polyketide 合酶基因), 插入位点位于终止密码前214 bp处. 由此证明, anrF基因与B8菌株的拮抗活性相关, 推测B8菌株产生的拮抗物质为andrimid.     

稻瘟病菌新无毒基因AvrPi7的遗传及物理作图

稻瘟病是目前最具毁灭性的作物病害之一. 本研究通过由田间菌株CHL346和CHL42杂交得到的189个子囊孢子菌株构建的分离群体, 在亲本菌株CHL346中鉴定到了与水稻稻瘟病抗性基因Pi7对应的无毒基因AvrPi7. 为了确定AvrPi7位点的染色体位置, 本研究开发了一套基于稻瘟病菌测序菌株70-15全基因组序列的121个微卫星(simple sequence repeat, SSR)标记. 利用这些SSR标记对AvrPi7位点进行了连锁分析. 结果表明, 位于第1染色体的8个SSR标记与该无毒基因连锁, 其中2个最近的侧翼标记MS1-9和MS1-15分别距离AvrPi7位点3.2和16.4 cM. 为了进一步完成该位点的精细作图, 在MS1-9和MS1-15的侧翼区域进一步开发了8个SSR标记和3个候选无毒基因(candidate avirulence gene, CAG)标记. 通过对这些标记的连锁分析, AvrPi7位点被界定于标记MS1-21和MS1-22之间1.6 cM的区域内, 并与标记CAG2共分离. 为了构建该无毒位点的物理图谱, 通过生物信息学分析(bioinformation analysis, BIA), 将与该基因连锁的分子标记分别着陆于参考菌株70-15的超重叠群(supcontig)上. AvrPi7位点最终被界定在标记MS1-21和MS1-22之间的75 kb区段内. 本研究的结果对于进一步了解真菌中普遍存在的重组不平衡和部分二倍体等现象, 以及对该基因进行克隆及其功能研究具有重要意义.     

固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转移酶DctPQM的跨膜结构分析与功能研究

固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501四碳二羧酸转移酶系由dctPQM基因编码. 基因序列和结构分析表明, dctP, dctQ和dctM紧密连锁, 并在核苷酸和氨基酸水平上与自生固氮菌棕色固氮菌的四碳二羧酸结合蛋白基因dctP和转运蛋白基因dctQM高度同源. 经分析表明, DctP不含跨膜区, DctQ包含5个跨膜区, DctM包含12个跨膜区. 为验证四碳二羧酸转运系统对固氮能力的增强作用, 将含有完整dctPQM基因的DNA片段连接在自杀性转移质粒载体pSZ21的Tn5转座区域中, 获得重组质粒pSZY6. 采用三亲接合方法, 经Tn5转座作用将dctPQM基因随机插入到野生型菌株A1501的染色体上, 构建了重组菌株A-142. 经nptⅡ基因的PCR扩增实验证明, 该重组菌株确实携带了额外拷贝的dct结构基因. 该重组菌株以不同浓度的琥珀酸、延胡索酸和苹果酸(20, 10和5 mmol/ L)为惟一碳源生长时, 其固氮活性均明显高于野生型菌株A1501, 表明额外拷贝的四碳二羧酸转移酶系编码基因dctPQM能增强受体菌的固氮能力.     

海岛棉GbKTN1对酵母细胞伸长的影响

用5′RACE/3′RACE从海岛棉(Gossypium barbadense)开花后10 d的纤维细胞中分离获得了GbKTN1 cDNA序列, 全长2006 bp, 包括113 bp的5′非翻译区、1563 bp的可读框及327 bp的3′非翻译区(不包括终止密码子TAA). 可读框编码521个氨基酸, 蛋白质分子量约为55 kD, 靠近GbKTN1 C末端的233~414 氨基酸残基间包含一个ATP结合功能区. Southern杂交证明, GbKTN1在海岛棉基因组中以单拷贝形式存在. 半定量RT-PCR结合Southern杂交分析表明, GbKTN1在海岛棉根、茎、叶及纤维细胞中均有表达, 以纤维细胞中的表达最高, 叶中最低. 利用裂殖酵母系统, 初步分析了GbKTN1对细胞伸长的功能, 发现该基因在酵母细胞中诱导表达后使细胞显著伸长, 平均为诱导前的2.18倍, 部分细胞呈不规则形状, 这是首次在活体(in vivo)中证明KTN1与细胞的伸长有关.     

转座元件介导的苯胺代谢基因簇的筛选和鉴定

利用苯胺不完全降解时中间代谢产物, 如邻苯二酚等的显色反应, 建立了简便快速的苯胺代谢途径相关基因的功能筛选方法. 从苯胺降解菌株AD9的基因组文库中筛选得到3个阳性重组子pDA1, pDB2和pDB11. AD和C23O酶活测定结果表明, pDA1和pDB11分别含有功能完整的苯胺双加氧酶或邻苯二酚双加氧酶编码基因. 经核苷酸序列分析和拼接获得一个大小为24.7 kb, 含25个可读框的苯胺代谢基因簇, 其中含有17个基因与苯胺代谢有关, 包括调控基因tadR, 苯胺双加氧酶基因簇tadQTA1A2B, 邻苯二酚间位裂解途径酶系基因簇tadD1C1D2C2EFGIJKL. 苯胺代谢基因簇两侧含有转座酶和IS1071序列.     

阿维菌素B产生菌寡霉素合成阻断株的构建

以仅产阿维菌素(avermectin) B和寡霉素(oligomycin)的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)CZ8-73为出发菌株, 构建基因缺失载体pXL05(pKC1139∷ΔolmA1 + ΔolmA4), 并将其转入CZ8-73中, 通过缺失质粒和染色体之间的同源双交换, 对染色体上长达90 kb的寡霉素PKS基因簇(olmA)进行了缺失突变. 将4株经Southern杂交验证正确的基因缺失突变株进行摇瓶发酵和HPLC检测, 发现4个突变株均不再产生寡霉素而仅产阿维菌素B组分, 阿维菌素的总产量和B1的产量与出发菌株相当, 说明寡霉素PKS基因簇的缺失并不影响阿维菌素的生物合成. 该缺失突变是在染色体上通过同源双交换完成的, 不会发生进一步的重组, 因此突变株性状稳定, 在工业生产上具有应用价值.     

一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

细菌Ⅱ型分泌途径控制产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes) S2中卵磷脂酶的分泌

从水稻根际分离筛选出1株降解卵磷脂的有机磷降解细菌菌株S2, 通过形态指标、生理生化性状、16S rDNA序列、(G+C)含量以及DNA-DNA杂交分析, 鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes). 采用双亲接合的方法将带有Tn5转座子的质粒导入产碱假单胞菌S2菌株中进行转座子插入诱变, 从5000个卡那霉素抗性的Tn5插入突变株中, 筛选到3株丧失解磷能力的突变株(M808, M1329和M1400)和1株解磷能力增强的突变株(M20). 对Tn5插入位点的基因进行DNA测序表明, 丧失解磷能力突变株中被突变的基因分别是xcpS, xcpX和xcpW, 它们分别编码XcpS, XcpX和XcpW蛋白, 这些蛋白是细菌Ⅱ型分泌途径中的主要成分. 将xcpS, xcpX和xcpW基因分别构建在pLAFR3载体上, 通过双亲接合的方式分别导入上述M808, M1329和M1400三个丧失解磷能力突变株中进行功能互补实验, 结果表明这3个基因都能使各自相对应的突变株恢复解磷能力. 以上结果表明, 在产碱假单胞菌中卵磷脂酶的分泌是通过Ⅱ型分泌途径来完成的. 解磷能力的丧失可能是由于Tn5插入xcp基因簇中的某一基因破坏了卵磷脂酶向胞外的分泌, 造成突变株不能降解有机磷. 在解磷能力增强突变株M20中, 被突变的基因与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PAO1中的chpA基因(参与细菌的颤动)同源性达88%.     

水稻半矮秆基因sd-g的精细定位

矮秆基因的发掘、研究和利用是水稻株型改良育种和植物生长发育分子生物学研究的重要基础. 利用新桂矮双矮与02428杂交产生的F₂群体对sd-g进行了精细定位. sd-g基因首先被定位在水稻第5染色体上微卫星标记RM440和RM163之间, 遗传距离分别是0. 5和2.5 cM. 为了进一步精细定位sd-g基因, 利用已经公布的水稻基因组序列, 在sd-g基因附近区域寻找微卫星序列并发展新的标记, 在RM440和RM163之间发展了9个微卫星标记. sd-g基因被进一步定位在SSR5-1和SSR5-51之间, SSR5-1与sd-g之间距0. 1 cM, SSR5-51与sd-g之间相距0. 3 cM, 而SSR418与sd-g表现为共分离. 以此为基础, 构建覆盖sd-g基因区域的BAC重叠群, sd-g基因被定位在AC105319约85 kb的区段上, 这为sd-g基因的图位克隆奠定了基础.     

外源基因定向插入甘蓝型油菜C基因组

外源基因定向插入C基因组对于降低转基因甘蓝型油菜(Brassica napus, AACC)的生态环境风险具有十分重要的作用. 本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法将抗除草剂bar基因转入到芥蓝(B. oleracea var. alboglabra, CC)中, 以转bar基因的芥蓝(C^bC^b)为父本, 非转基因的白菜(B. rapa, AA)为母本, 通过种间杂交、子房培养和染色体加倍, 获得bar基因定向插入C基因组的人工合成甘蓝型油菜株系67个. PCR结果表明, 人工合成的甘蓝型油菜bar基因为阳性的株系31个, 阴性的株系36个. Basta®喷施结果表明, 分子检测阳性的人工合成甘蓝型油菜高抗除草剂, 分子检测阴性人工合成甘蓝型油菜则不抗. Southern blotting分析结果表明, 外源bar基因已整合到人工合成甘蓝型油菜的基因组中.     

水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24 kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因. 利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合, 构建了含4892个单株的F₂定位群体. 同时, 利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库, 构建了一个覆盖目标基因位点的长约213 kb的跨叠克隆群. 根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列, 以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序, 设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位. xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离, 标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM, 物理距离约为24 kb. 对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测, 揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因. 对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法构建产氢重组菌

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产H₂的主要副产物, 每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H, 从而降低了H₂的产量. 本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhE基因为改造目标, 利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的K. oxytoca重组菌. 构建工作包括: 根据adhE基因保守序列框克隆K. oxytoca HP1 adhE基因片段, 以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增, 表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhE基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒, 同源整合质粒pTA-Str的构建, 以链霉素作为筛选标记筛选重组菌. 菌落PCR鉴定结果表明, aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入K. oxytoca HP1基因组中, 成功地构建了adhE基因部分片段缺失的重组菌. 葡萄糖发酵实验结果表明, 相同发酵条件下, 重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%, 乙醇产量下降了70.47%. 利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.     

水稻Ac/Ds系统的Ds转座行为

将玉米的转座子系统Ac/Ds导入水稻基因组中诱导产生突变体的方法已成为构建水稻插入突变体库的主要策略之一. 本研究通过水稻Ds-T-DNA转化纯合体和Ac-T-DNA转化纯合体的杂交, 构建水稻的Ac/Ds双因子转座系统, 对F₁~F₅代的Ds转座行为进行了研究. 通过转座检测, 发现1例Ds转座引起约170 bp T-DNA载体序列的缺失, 另1例Ds转座插入基因组时带有一段272 bp的T-DNA载体序列. 对F₁~F₅代Ds转座的连续检测结果表明, 配子体转座频率随世代的增加而提高, F3代的配子体转座频率达54.2%. 采用TAIL-PCR的方法扩增Ds元件旁侧的基因组序列, 对17个TAIL-PCR产物的序列进行了分析, 发现有5例Ds插入到基因序列中, Ds既可发生邻近位置的转座, 也可发生不连锁的转座, Ds在染色体间的转座频率为33.3%.     

鲤科鱼类的c-myc CDS及其系统发育关系

鲤科鱼类在东亚的物种多样, 分布广泛, 物种特征尺寸差异明显, 弄清其功能基因的系统演变, 对于理解物种分化和功能进化具有重要意义. 以具有重要生长调控作用的c-myc基因为标记, 通过PCR扩增、克隆和测序, 共获得41种鲤科鱼类和外类群c-myc基因全序列, 发现并分析了c-myc编码区的两个高变异区. 基于c-myc CDS序列, 分别采用最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和Bayesian法重建了鲤科鱼类的系统发育关系. 3种方法所得系统发育关系较为相似. 当以亚口鱼科的胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)、鳅科的泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)和平鳍鳅科的中华间吸鳅(Hemimyzon sinensis)作为外类群, 3种方法重建的系统分支图均以较高的节点支持率支持鲤科鱼类中雅罗鱼系和鲃系的划分, 雅罗鱼系包括雅罗鱼亚科(Leuciscinae)的东亚种类、鲴亚科(Xenocyprinae)、鲌亚科(Cultrinae)、 亚科(Danioninae)东亚土著种类, 亚科(Gobioninae)和鳑鲏亚科(Acheilognathinae). 鲃系包括裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、鲃亚科(Barbinae)、鲤亚科(Cyprininae)和野鲮亚科(Labeoninae). 斑马鱼(Danio rerio)、麦氏 (D. myersi)和三线波鱼(Rasbora trilineata)应从雅罗鱼系或鲃系中分出, 形成另外的一个系群. 亚科是一个多起源的复合类群, 其中一些种类归属存在较多问题, 对 亚科一些种类有必要重新划分. c-myc CDS翻译成蛋白质后, 逐个分析具有简约信息氨基酸变异发现氨基酸位点变异与鱼类特征尺寸之间无相关性. 同时分析并发现c-myc编码区内两个高变异区序列变异既不能体现物种分化关系, 也与物种特征尺寸无相关性. 本研究还发现每一类群位于分支图基部较为原始的种类一般鱼类物种尺寸较小, 可能是对原始生态和生存压力适应的结果.     

水稻花优势表达基因RA68的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻花中克隆了1个编码含丰富脯氨酸和苏氨酸结构域多肽的cDNA, 其相应的基因命名为RA68. RA68含3个外显子和2个内含子, 编码由219个氨基酸残基组成的蛋白质. 数据分析结果显示, 该蛋白由1个22个氨基酸残基组成的信号肽, 1个亲水性的N-端结构域和1个疏水性的C-端结构域组成. N-端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列. Southern blot和序列分析结果表明, RA68在水稻基因组以单拷贝存在, 定位于第2号染色体. Northern杂交结果表明, RA68在幼芽和花中表达量较高, 在根和叶中不表达. 花和幼芽进行原位杂交分析结果表明, 在花中, RA68在花粉母细胞、二分体细胞、单核花粉粒以及大孢子囊中表达. 基于该基因的表达特性及其编码蛋白质的结构特征, 探讨了其在花发育中的可能功能.     

阿维链霉菌adpA-a调控形态分化和黑色素形成

灰色链霉菌(Streptomyces griseus)中的AdpA是A-因子调控网络中的一个中心转录调控因子, 控制形态分化和次级代谢. 在阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的基因组上, 也存在着与adpA高度同源的基因adpA-a. 为了研究其功能, 通过同源双交换将adpA-a基因破坏, 得到的adpA-a突变株不能进行正常的形态分化, 同时不再产生黑色素, 但产阿维菌素(avermectin)的能力不受影响. 对该破坏菌株进行基因互补, 互补突变株的表型得到恢复, 证实了突变株表型变化是由adpA-a破坏引起的. 以上结果表明, 在阿维链霉菌中, adpA-a不仅参与形态分化的调控, 同时也参与黑色素生物合成的调控.     

抑制4CL基因表达获得低木质素含量的转基因毛白杨

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将反义4CL(4-coumarate:CoA ligase, 4-香豆酸辅酶A连接酶)基因转入三倍体毛白杨(Populus tomentosa). PCR及Southern检测证实外源基因已整合到转基因植株总基因组中. RT-PCR和Western检测表明反义4CL基因在转基因植物体内已表达. Klason木质素含量测定结果显示, 抑制内源4CL基因的表达可显著降低转基因株系的木质素含量, 比非转基因对照下降最高达41.73%. 但综纤维素含量测定结果表明, 转基因植株与对照没有明显区别, 推测4CL可能并非木质素与碳水化合物的代谢调节点. 转基因植株茎杆剥皮后呈现程度不等的红褐色, 而对照为白色, 其他生长发育特征与对照无明显差异. Wiesner反应结果表明, 木质素含量下降的株系呈红色, 而对照呈典型紫红色.     

HIV-1gp41不同片段表达对E. coli细胞毒性作用分析

HIV-gp41基因在E. coli中难以表达, 为研究影响其表达的原因, 选择gp41不同区域构建表达质粒, 通过在E. coli BL21(DE3)中进行表达测定其对细菌的毒性作用. 结果表明, IPTG诱导后除质粒pET-HN2表达菌以外其余质粒表达菌大量死亡, 目的基因转录的mRNA量也迅速下降, [³H]尿嘧啶释放实验显示释放增加, 说明GP41蛋白的毒性作用主要表现为对表达菌细胞膜的破坏而成为其在E. coli中难以表达的主要原因.     

phbB基因在莱茵衣藻中的表达与分子检测

通过构建依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)的衣藻表达载体, 用石英砂VOTEX转化技术, 将phbB基因导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii cc-849)中, 用含有10 μg/mL的Zeomycin的平板培养基进行筛选和实验室保持培养, 得到了表达phbB基因的转基因藻株. PCR和Southern blot结果显示phbB基因已整合到莱茵衣藻基因组中. RT-PCR与DNA杂交的检测结果显示, 导入的phbB基因在衣藻中具有转录活性.     

水稻稀穗突变体的遗传分析及基因的精细定位

水稻稀穗突变体lax影响花序发育的主要特征是: 穗轴上能形成正常的一次、二次枝梗, 侧生小穗的发育被完全阻断, 只在枝梗的顶端发育形成单个小穗, 且小花呈多种异常变异. 突变体与粳稻品种W11杂交获得F₂分离群体. 以该F₂分离群体为基础, 根据水稻基因组序列设计微卫星引物和CAPS标记, 并进行连锁分析, 将稀穗基因定位在水稻第1染色体长臂的CAPS标记HB2和微卫星标记MRG4389之间, 与两标记间的距离均为0.14 cM, 与CAPS标记LZ1共分离. RT-PCR分析结果显示, 在稀穗突变体中与花器官发育相关的B功能基因OsMADS2, OsMADS4, OsMADS16 以及C功能基因OsMADS3的转录水平明显下降, 而A功能基因 RAP1A的转录水平未受到影响.