链霉菌M1033同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株的构建

为实现有工业生产价值的葡萄糖异构酶双突变体酶ＧＩ（Ｇ１３８Ｐ－Ｇ２４７Ｄ）的稳定高效表达，在建立７号淀粉酶链霉菌Ｍ１０３３原生质体转化条件的基础上，构建了含６００ｂｐ不完整ＧＩ（Ｇ１３８Ｐ－Ｇ２４７Ｄ）结构基因片段的插入型同源重组质粒ｐＸＷ，并通过同源重组模式整合到Ｍ１０３３的染色体上，实现了ＧＩ基因的破坏（ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ），获得了同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株。对同源重组片段的分     

Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法构建产氢重组菌

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产H₂的主要副产物, 每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H, 从而降低了H₂的产量. 本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhE基因为改造目标, 利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的K. oxytoca重组菌. 构建工作包括: 根据adhE基因保守序列框克隆K. oxytoca HP1 adhE基因片段, 以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增, 表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhE基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒, 同源整合质粒pTA-Str的构建, 以链霉素作为筛选标记筛选重组菌. 菌落PCR鉴定结果表明, aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入K. oxytoca HP1基因组中, 成功地构建了adhE基因部分片段缺失的重组菌. 葡萄糖发酵实验结果表明, 相同发酵条件下, 重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%, 乙醇产量下降了70.47%. 利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）固氮调节基因ｎｉｆＡ对大豆根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）ＨＮ０１ｌｕｘ的结瘤固氮效率有促进作用。首先构建一个带有Ｋｐ ｎｉｆＡＨ的重组质粒ｐＸＤ１,使ｎｉｆＡ在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达。当质粒ｐＸＤ１转移至大豆根瘤菌ＲｆＨＮ０１ｌｕｘ后,获得带Ｋｐ ｎｉｆＡ的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显     

人神经元电压门控钙通道γ-3基因的克隆

将小鼠Ｃａｃｎｇ２基因的编码区与ＥＳＴ数据库进行同源性分析，得到一个与小鼠Ｃａｃｎｇ２基因在 ４３５ ｂｐ中有 ７５％同源的 ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ： Ｗ２９０９５）．在该 ＥＳＴ中设计引物与 ｃＤＮＡ文库载体臂上引物行巢式 ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ反应，在人脑前叶皮质 ｃＤＮＡ文库和人脑 Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ中获得 ｃＤＮＡ序列 １５４５ ｂｐ，其中包含一个 ９４８ ｂｐ的可读框，编码 ３１５个氨基酸．该可读框经确证命名为 ＣＡＣＮＧ３．ＣＡＣＮＧ３基因与大规模测序中定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１的ＢＡＣ克隆ＡＣ００４１２５完全一致，从而将该基因定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１，并由此获得它的基因组结构，编码区由４个外显子组成．经ＲＴ－ＰＣＲ分析，ＣＡＣＮＧ３在成人脑和胎脑有表达．运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ在视网膜色素变性家系、视网膜色素变性伴耳聋和癫痫家系进行突变检测，未检测到突变．     

烟草花器官实体基因的部分序列及其表达

以烟草花芽的ｃＤＮＡ一链为模板扩增出３个花器官实体基因的同源序列ＮＴＳＱＵＡ４,ＮＴＳＱＵＡ１２和ＮＴＳＱＵＡ１５。这３个克隆都包含有典型的花器官实体基因所拥的的结构域：Ｉ区,Ｋ区和Ｃ末端区。同Ａ类基因ＡＰ１和ＳＱＵＡ的氨基酸序列相比,这３个克隆有５０％－６０％的残基与它们相同。     

人类肽-甲硫氨酸亚砜还原酶的cDNA克隆、组织表达谱特征及染色体定位

蛋白质结构中某些氨基酸的氧化和还原是生物体内对蛋白功能的一种调控方式．甲硫氨酸（Ｍｅｔ）被氧化则变为甲硫氨酸亚砜（Ｍｅｔ（Ｏ）），它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失，但肽－甲硫氨酸亚砚还原酶（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ， ｍｓｒＡ）则可使甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸，使其所在蛋白质重新恢复活性．为了研究人体中Ｍｅｔ氧化还原的机制，以牛ｍｓｒＡ ｃＤＮＡ序列为信息探针，筛选人ＥＳＴ数据库，依据若干同源ＥＳＴ的信息从人ｃＤＮＡ分子库中克隆到一个长１２５５ｈｐ的人ＭＳＲＡ ｃＤＮＡ．该ＣＤＮＡ包含一个长７０５ ｂｐ的可读框，它编码了 ２３５个氨基酸残基．同源性比较表明，该基因与牛和大肠杆菌的ｍｓｒＡ基因的氨基酸一致性分别为８８％和６１％．表达谱分析发现，该基因在人体大多数组织中均有一条长约１．６ｋｂ的转录本，并在肾中呈高表达．应用辐射杂种细胞株定位系统（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｐａｎｅｌ， ＲＨ ｍａｐｐｉｎｇ）将该基因精确定位在人染色体８ｐ２２～２３区带的ＤＳＳ５１８和Ｄ８５５５０位标之间，由于此前已有Ｋｅｒａｔｏｌｙｔｉｃｗｉｎｔｅｒｅｒｙｔｈ     

水稻减数分裂相关基因OsDMC1的克隆

酵母ＤＭＣ１基因是一个在减数分裂前期 Ｉ表达的减数分裂特异基因，其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的．根据在酵母Ｄｍｃ１与拟南芥ＡｔＤｍｃ１中保守的氨基酸ｍｏｔｉｆｓ合成的简并性引物，以ｃＤＮＡ作模板，通过套式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）和ＲＡＣＥｓ克隆了水稻中酵母ＤＭＣ１的同源基因 ＯｓＤＭＣ１．ＯｓＤＭＣ１全长的 ｃＤＮＡ是 １３４８ ｂｐ，编码 ３４４个氨基酸组成的多肽（ＯｓＤｍｃ１）． ＯｓＤｍｃ１与 Ｄｍｃ１和ＡｔＤｍｃ１的氨基酸序列一致性分别是５１．８％和８１．７％．ＯｓＤＭＣ１在生殖器官中表达量较高，在根中有少量表达，而在叶和幼芽中不表达． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果表明水稻基因组中有两个拷贝的 ＯｓＤＭＣ１．     

TMV-RNA 非翻译区对外源基因在整体植物中表达水平的影响

利用ＧＵＳ基因及ＴＭＶ－ＲＮＡ非翻译区序列构建了４种ＧＵＳ基因的植物表达载体，即ｐＢＧ４３７，ｐＢＧ４３８，ｐＢＧ４４０和ｐＢＧ４４０△ＮＯＳ。在这４种表达载体中带双增强子的３５Ｓ启动子的下游分别由ＧＵＳ－ＮＯＳ，Ω－ＧＵＳ－ＮＯＳ，Ω－ＧＵＳ－３’ＵＴＲ－ＮＯＳ和Ω－ＧＵＳ－３’ＵＴＲ组成４个不同的表达框架。转基因烟草ＧＵＳ活性检测表明，转ＰＢＧ４４０植株的ＧＵＳ活性是转ｐＢＧ４３７的５倍，是转     

带有preS抗原决定簇的乙肝表面抗原的DNA免疫研究

构建了３种融合了ｐｒｅＳ抗原决定簇的乙肝表面抗原的表达质粒。在ＣＯＳ－Ｍ６细胞中暂时表达的结果显示,在ＣＭＶ启动子转录调控下融合基因表达的蛋白可以有效地分泌至细胞外,并且同时具有ＨＢｓＡｇ,ｐｒｅＳ１和ｐｒｅＳ２抗原性。带有ｐｒｅＳ抗原决定簇顺序的质粒ＤＮＡ直接免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后,能诱发小鼠产生抗Ｓ抗体,抗体滴度高于仅带有Ｓ基因的表达质粒。     

Pfu酶基因的克隆、表达、纯化及长距离PCR的研究

用ＰＣＲ方法从Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ的总ＮＤＡ扩增出了含有Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌＡ基因的２．３ｋｂ片段,并将该基因克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体。用ＮｃｏＩ和ＸｈｏＩ对重组质粒ｐＴ－ｐｆｕ进行了酶切。并将ｐｆｕ ｐｏｌＡ基因捶 入表达载体ｐＥＴ－３ｄ－Ｘ。     

转基因马铃薯中病原诱导GO基因的表达及其对晚疫病的抗性

利用ＰＣＲ技术从黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中扩增并克隆了葡萄糖氧化酶（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ，简称ＧＯ）基因，并将马铃薯病原诱导型启动子（Ｐｒｐ１－１基因启动子）与其融合构建了植物表达载体ｐＣＡＭＧＯ。经农杆菌介导转化获得了转基因植株，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交显示葡萄糖氧化酶基因整合进马铃薯基因组。该基因的表达及所引起的Ｈ２Ｏ２的生成由淀粉－ＫＩ的显色反应得到证实。用马铃薯晚     

高粱psbA基因启动子“-35”元件的突变效应

应用化学合成的２０ｎｔ寡核苷酸引物，诱导高粱ｐｓｂＡ基因启动子“－３５”元件（ＴＩＧＡＣＡ）中的第１位Ｔ碱基和第３位Ｇ碱基发生突变，获得３个突变体ＡＴＴＡＣＡ，ＧＴＧＡＣＡ和ＡＴＧＡＣＡ，在菠菜叶绿体蛋白质提取物系统中，检测突变的及野生型的高粱ｐｓｂＡ基因启动子与蛋白质的结合能力。凝胶阻滞实验结果表明，野生型的具有很强的蛋白质结合条带，单碱基突变的ＡＴＧＡＣＡ和ＧＴＧＡＣＡ的蛋白质条带的强度明显下     

人类细胞因子信号传导抑制因子基因humSOCS-2的分离与克隆

采用国际ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ数据库同源筛选的策略,筛选到１个与小鼠细胞因子信号传导抑制因子基因ｍｍＳＯＣＳ－２高度同源的ＥＳＴ９ｇｂＡＡ１１５２３９）,在人胎盘ｃＤＮＡ分子库中步移获得一长１０１１ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,包含一个长５９４ｂｐ的开放阅读框,编码了１９８个氨基酸残基,经ＮＣＢＩ数据库检索是一个全新的基因。     

P15INK4b/MTS2对人肝癌细胞增殖的影响及其机理的初步分析

利用自行构建的稳定高表达Ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ的人肝癌细胞，研究了抑癌基因Ｐ１５在细胞增殖中的作用．首先将抑癌基因 Ｐ１５的 ｃＤＮＡ构建到高效真核表达的质粒载体 ｐＸＪ４１－ｎｅｏ中的 ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ位点，构建成 Ｐ１５真核表达质粒 ｐＸＪＰ１５．通过脂质体法将 ｐＸＪＰ１５质粒转染人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１，进一步用 Ｇ－４１８筛选，获得了稳定高表达Ｐ１５的人肝癌细胞模型ＳＨＴ及相应的表达空载体的对照细胞模型ＳＶＸＪ．通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ，Ｗｅｓｔｅｒｎ分子杂交分析，表明ＳＨＴ细胞中Ｐ１５基因表达和蛋白水平都明显高于对照组细胞，证实成功地建立了Ｐ１５高表达的人肝癌细胞模型，与对照组相比，Ｐ１５高表达的ＳＨＴ１细胞的增殖受到抑制，流式细胞光度术和ＭＩ值测定表明Ｐ１５阻抑细胞由Ｇ１期向Ｓ期和由Ｇ２期向Ｍ期的转换．Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析结果表明，癌基因ｃ－ｍｙｃ，ｃ－ｆｏｓ的蛋白水平表达下降可能是Ｐ１５抑制细胞增殖的分子机理之一。     

用低能氩离子束介导将水稻几丁质酶基因导入小麦

用低能氩离子束介导将构建的ｐＣＡＭＢＩＡ１３０８质粒载体上携带的几丁质酶基因（ＲＣＨ８）导入３个小麦栽培品种扬麦１５８，皖９２１０，皖麦３２号的成熟胚细胞，来自成熟胚的初生愈伤组织转Ｈｍ浓度为１０－２０ｍｇ／Ｌ潮霉素（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ，Ｈｍ）的培养的筛选培养，获得的抗性伤组织转入Ｈｍ浓度为１０－２０ｍｇ／Ｌ的培养基上进行分化培养，３个小麦品种都获得了再生植株，再生苗ＰＣＲ和ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅ     

稻瘟病病原物诱导启动子的构建及表达

利用ＰＣＲ技术从小麦和马铃薯中分别扩增并克隆了病原诱导性谷胱甘肽－Ｓ－转移酶基因ＧｓｔＡｌ和Ｇｓｔｌ启动子片段，将它们分别与水稻肌动蛋白基因（Ａｃｔｌ）核心启动子序列、５’端非翻译前导序列以及ＧＵＳ基因融合构建出植物载体ｐＷＭＩＧ－５０和ｐＰＭＩＧ－５０，然后转化水稻，并对嵌合启动子的诱导活性进行了分析。结果表明：（１）在转基因水稻细胞中嵌合启动子可受稻瘟病病原物的诱导；（２）水稻Ａｃｔｌ第一内含     

表达cryIA/gna双价抗虫基因烟草兼抗棉铃虫和蚜虫

利用人工合成的、密码子优化后的雪花莲凝集素（ＧＮＡ）基因，与人工合成的ＣＦＭ ｃｒｙＩＡ构建了双价抗虫基因植物高效表达载体。通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得２８株卡那酶素抗性植株，经ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹检测，证实了双价抗虫基因在烟草基因组中的整合，转基因烟草杀棉铃虫试验表明，４０％转基因烟草植株对棉铃虫具有高抗性；Ｂｔ杀虫蛋白ＥＬＩＳＡ检测获得与虫试较一致结果，抗虫性较强株Ｋ１１号ＣｒｙＩ     

膜结合型巨噬细胞集落刺激因子介导的内吞及其半衰期

膜结合型巨噬细胞集落刺激因子（ｍ－Ｍ－ＣＳＦ）是巨噬细胞集落刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）的异型体，兼有粘附分子和反向传导信号的作用．以ｍ－Ｍ－ＣＳＦ高表达的Ｊ６－１细胞系为模型，研究了重组人 Ｍ－ＣＳＦ可溶性受体（ｒｈ－Ｍ－ＣＳＦ－ｓＲ）与 ｍ－Ｍ－ＣＳＦ的结合、内化和再循环．结果显示： ｍ－Ｍ－ＣＳＦ与 ｒｈ－Ｍ－ＣＳＦ－ｓＲ的结合具高亲和性（ Ｋｄ＝ １．７８×１０－１２ ｍｏｌ／Ｌ），且 ｍ－Ｍ－ＣＳＦ能介导能量和温度依赖的 ｒｈ－Ｍ－ＣＳＦ－ｓＲ内化（ｔ_１／２＝ ２０ｍｉｎ）；内化的 ｒｈ－Ｍ－ＣＳＦ－ｓＲ能以 ｍ－Ｍ－ＣＳＦ结合的形式回到细胞表面，表明： ｍ－Ｍ－ＣＳＦ有受体样介导内化和再循环作用．用间接免疫荧光法和流式细胞仪测定了４株白血病细胞系和正常人脐血单个核细胞的ｍ－Ｍ－ＣＳＦ、膜结合型Ｍ－ＣＳＦ－Ｒ、胞质和胞核Ｍ－ＣＳＦ及胞质和胞核Ｍ－ＣＳＦ－Ｒ的半衰期，结果显示：４株白血病细胞系的各种Ｍ－ＣＳＦ和Ｍ－ＣＳＦ－Ｒ半衰期均长于正常人脐血单个核细胞相应Ｍ－ＣＳＦ和Ｍ－ＣＳＦ－Ｒ的半衰期，提示：白血病细胞降解Ｍ－ＣＳＦ和Ｍ－ＣＳＦ－Ｒ的速率明显降低；胞内Ｍ－ＣＳＦ和Ｍ－ＣＳＦ－Ｒ在瘤细胞中的作用值得研究．     

维甲酸对人腹主动脉平滑肌细胞增殖的影响

通过免疫组织化学和电子显微镜的方法鉴定了原代培养的人腹主动脉平滑肌细胞且研究全反式维甲酸对其增殖的影响,发现ａｔＲＡ使ＳＭＣ的增殖速度变慢,经ａｔＲＡ处理的细胞中ｃｙｃｌｉｎＤ１,ＣＤＫ４的表达分别降低了３９％和３８％,ｃ－ｍｙｃ基因的表达的平降低了４３．６％,而平滑肌牧场划的ａ－ａｃｔｉｎ的表达不受影响。说明ａｔＲＡ可能通过降低细胞中ｃ－ｍｙｃ,ＣＤＫ４,ｃｙｃｌｉｎＤ１的基因表达水平而抑制ＳＭ     

玉米S组CMS线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建

细胞质雄性不育（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，ＣＭＳ）材料在杂交玉米生产中具有重要的应用价值，决定ＣＭＳ遗传性状的基因位于线粒体内，Ｓ组玉米ＣＭＳ种质Ｍｏｌ１７ＣＭＳ－Ｊ为试材，采用低熔点琼脂糖包埋线粒体、原位消化、电泳分级、酶解琼脂糖ＢＡＣ载体、电转化等新技术，成功构建了线粒体基因文库。从基因文库的容量、插入片段大小、来源、稳定性和在文库中筛选线粒体基因等质量因素分析，表明