耳蕨属(鳞毛蕨科)的亚洲起源: 来自rbcL序列的证据

对60种(包括新测定的我国西南部的耳蕨和贯众属植物23种)广义耳蕨属Polystichum sensu lato (s.l.)植物的rbcL基因序列进行系统发育分析, 并根据通过相对速率检验支系之间的遗传距离和rbcL基因的进化速率, 估算广义耳蕨属起源和发生分歧的时间. 用最大简约法(MP)和邻接法(NJ)构建的系统发育树基本一致, 所分析的广义耳蕨属(包括贯众属Cyrtomium和鞭叶蕨属Cyrtomidictyum)构成一个单系群, 支持广义耳蕨属的成立. 位于系统树基部的支系均由来自亚洲的种类构成, 而来自全世界各地的其余种类构成另一个支系. 系统发育分析及分歧时间的估算结果显示, 广义耳蕨属在晚白垩世晚期(约76 Ma)首先从亚洲起源, 在始新世早期(约46 Ma)扩散到世界各地.     

鲤科鱼类的c-myc CDS及其系统发育关系

鲤科鱼类在东亚的物种多样, 分布广泛, 物种特征尺寸差异明显, 弄清其功能基因的系统演变, 对于理解物种分化和功能进化具有重要意义. 以具有重要生长调控作用的c-myc基因为标记, 通过PCR扩增、克隆和测序, 共获得41种鲤科鱼类和外类群c-myc基因全序列, 发现并分析了c-myc编码区的两个高变异区. 基于c-myc CDS序列, 分别采用最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和Bayesian法重建了鲤科鱼类的系统发育关系. 3种方法所得系统发育关系较为相似. 当以亚口鱼科的胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)、鳅科的泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)和平鳍鳅科的中华间吸鳅(Hemimyzon sinensis)作为外类群, 3种方法重建的系统分支图均以较高的节点支持率支持鲤科鱼类中雅罗鱼系和鲃系的划分, 雅罗鱼系包括雅罗鱼亚科(Leuciscinae)的东亚种类、鲴亚科(Xenocyprinae)、鲌亚科(Cultrinae)、 亚科(Danioninae)东亚土著种类, 亚科(Gobioninae)和鳑鲏亚科(Acheilognathinae). 鲃系包括裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、鲃亚科(Barbinae)、鲤亚科(Cyprininae)和野鲮亚科(Labeoninae). 斑马鱼(Danio rerio)、麦氏 (D. myersi)和三线波鱼(Rasbora trilineata)应从雅罗鱼系或鲃系中分出, 形成另外的一个系群. 亚科是一个多起源的复合类群, 其中一些种类归属存在较多问题, 对 亚科一些种类有必要重新划分. c-myc CDS翻译成蛋白质后, 逐个分析具有简约信息氨基酸变异发现氨基酸位点变异与鱼类特征尺寸之间无相关性. 同时分析并发现c-myc编码区内两个高变异区序列变异既不能体现物种分化关系, 也与物种特征尺寸无相关性. 本研究还发现每一类群位于分支图基部较为原始的种类一般鱼类物种尺寸较小, 可能是对原始生态和生存压力适应的结果.     

青藏高原三江源地区高寒草甸土反硝化细菌多样性的初步研究

应用PCR-RFLP和测序分析首次对青藏高原腹地三江源自然保护区高寒草甸土壤反硝化细菌基因(nirK和nosZ)的多样性和系统发育进行了探讨. 研究选用了4个海拔在4600 m以上的高寒草甸样地, 主成分分析表明样地间具有不同的理化性状. 经过PCR-RFLP分析, 在4个样品中分别获得253个nirK基因克隆和283个nosZ基因克隆, 其中nirK基因具有78个可操作分类单元(OTUs), nosZ基因具有120个OTUs. 环境因子分析表明, 海拔高度和土壤C/N比可能是影响土壤反硝化细菌的重要因素. 本研究还选取了36个nirK克隆和17个nosZ克隆进行部分基因测序分析, DNAMAN比较表明, nirK和nosZ基因序列间分别具有69%~98%和57%~97%的相似性. 在系统发育树中, 序列都可以分为4个不同的簇, 部分测定的基因序列与属于Proteobacteria的3个系统发育亚簇(α, β和γ)的已知反硝化细菌具有一定的亲缘关系, 另外一些序列与非培养细菌具有较近的亲缘关系.     

红树植物耐盐基因转化烟草及耐盐品系的培育

从耐盐性强的红树植物白骨壤(Avicennia marina)中分离出的耐盐基因CSRG1, 构建了pGAM189/CSRG1转基因载体. 以烟草嫩叶为外植体, 通过农杆菌介导的叶盘转化法将CSRG1基因及GUS基因, Km^r基因和Hyg^r基因转入烟草基因组中. 转化50个外植体, 经过50 mg/L潮霉素和150 mg/L卡那霉素抗性筛选共获得了13个稳定抗性株系. 通过PCR扩增检测、Southern blot分析和GUS基因活性检测, 结果表明, 最终获得的11个转基因品系(基因转化频率为22%)中, CSRG1基因整合到烟草的染色体DNA上. Northern blot分析结果表明, CSRG1基因在转基因植株中获得表达. 耐盐性测定和光合速率测定结果表明, 转基因植株在盐分提高到2% NaCl和全海水(盐度为24)配置的MS培养基中, 成活率保持在80%~90%, 株高增长20%~40%, CSRG1基因的表达产物及形成的生理代谢途径确实可使烟草获得较高的耐盐性, 同时这种耐盐性不仅针对钠离子胁迫, 而且对于各种离子的综合盐胁迫都具有耐受性.     

Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法构建产氢重组菌

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产H₂的主要副产物, 每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H, 从而降低了H₂的产量. 本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhE基因为改造目标, 利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的K. oxytoca重组菌. 构建工作包括: 根据adhE基因保守序列框克隆K. oxytoca HP1 adhE基因片段, 以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增, 表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhE基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒, 同源整合质粒pTA-Str的构建, 以链霉素作为筛选标记筛选重组菌. 菌落PCR鉴定结果表明, aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入K. oxytoca HP1基因组中, 成功地构建了adhE基因部分片段缺失的重组菌. 葡萄糖发酵实验结果表明, 相同发酵条件下, 重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%, 乙醇产量下降了70.47%. 利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.     

外源基因定向插入甘蓝型油菜C基因组

外源基因定向插入C基因组对于降低转基因甘蓝型油菜(Brassica napus, AACC)的生态环境风险具有十分重要的作用. 本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法将抗除草剂bar基因转入到芥蓝(B. oleracea var. alboglabra, CC)中, 以转bar基因的芥蓝(C^bC^b)为父本, 非转基因的白菜(B. rapa, AA)为母本, 通过种间杂交、子房培养和染色体加倍, 获得bar基因定向插入C基因组的人工合成甘蓝型油菜株系67个. PCR结果表明, 人工合成的甘蓝型油菜bar基因为阳性的株系31个, 阴性的株系36个. Basta®喷施结果表明, 分子检测阳性的人工合成甘蓝型油菜高抗除草剂, 分子检测阴性人工合成甘蓝型油菜则不抗. Southern blotting分析结果表明, 外源bar基因已整合到人工合成甘蓝型油菜的基因组中.     

用cpDNA matK基因和nrDNA ITS区序列确定我国特有植物四棱草属的系统位置

测定了我国特有植物四棱草属以及马鞭草科6属和唇形科13属共27个代表种的叶绿体DNA matK基因和核核糖体DNA ITS区序列. 应用相对表观衍征分析方法(RASA)对所测DNA序列的系统发育信号及所选择外类群的有效性进行了统计评价. 应用最大简约法(MP)、邻接法(NJ)和最大似然法 (ML)对matK和ITS序列进行了独立的和联合的分子系统发育分析. 结果表明, 四棱草与三花莸为姐妹群; Contino等提出的莸属复合群不构成单系类群, 莸属4种具有复系演化关系; Contino系统中的筋骨草亚科形成一个单系分支. 此外, 本文结果支持马鞭草科与唇形科构成复系类群以及白骨壤属从马鞭草科中独立的观点. RASA分析和多基因联合分析为确定复杂类群间的系统发育关系提供了有效的途径.     

水稻幼穗分化受阻突变体lhd的遗传分析与基因定位

从圭630/台湾粳的F₁花药培养后代群体中发现了水稻幼穗分化受阻突变体lhd(leafy head), 其植株明显矮化, 叶片细小且丛生, 始终停留在营养生长阶段. 遗传分析表明, lhd受一对隐性基因控制, 该突变基因拟命名为lhd (t). 显然, LHD(t)是控制花序分化的关键基因. 以lhd杂合体与明恢77和京花8号杂交, 建立了2个F₂群体. 在与京花8号杂交的F₂群体中, 部分lhd植株表现出“中间类型”, 说明遗传背景会影响突变性状的表现. 利用已公布的水稻RM系列SSR标记及自行设计的SSR标记, 结合BSA和突变株(共498株)分析, 将LHD(t)基因定位在第10染色体长臂端, 其中标记SSR1, RM269, RM258, RM304和RM171位于一侧, 与LHD(t)的图距分别为6.4, 16.6, 18.4, 22.2和26.3 cM; SSR4和SSR5位于另一侧, 与LHD(t)的图距分别为0.6和2.2 cM. 该结果为进一步对LHD(t)的克隆和表达研究奠定了基础.     

水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24 kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因. 利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合, 构建了含4892个单株的F₂定位群体. 同时, 利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库, 构建了一个覆盖目标基因位点的长约213 kb的跨叠克隆群. 根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列, 以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序, 设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位. xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离, 标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM, 物理距离约为24 kb. 对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测, 揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因. 对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转移酶DctPQM的跨膜结构分析与功能研究

固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501四碳二羧酸转移酶系由dctPQM基因编码. 基因序列和结构分析表明, dctP, dctQ和dctM紧密连锁, 并在核苷酸和氨基酸水平上与自生固氮菌棕色固氮菌的四碳二羧酸结合蛋白基因dctP和转运蛋白基因dctQM高度同源. 经分析表明, DctP不含跨膜区, DctQ包含5个跨膜区, DctM包含12个跨膜区. 为验证四碳二羧酸转运系统对固氮能力的增强作用, 将含有完整dctPQM基因的DNA片段连接在自杀性转移质粒载体pSZ21的Tn5转座区域中, 获得重组质粒pSZY6. 采用三亲接合方法, 经Tn5转座作用将dctPQM基因随机插入到野生型菌株A1501的染色体上, 构建了重组菌株A-142. 经nptⅡ基因的PCR扩增实验证明, 该重组菌株确实携带了额外拷贝的dct结构基因. 该重组菌株以不同浓度的琥珀酸、延胡索酸和苹果酸(20, 10和5 mmol/ L)为惟一碳源生长时, 其固氮活性均明显高于野生型菌株A1501, 表明额外拷贝的四碳二羧酸转移酶系编码基因dctPQM能增强受体菌的固氮能力.     

转大豆GmDREB基因增强小麦的耐旱及耐盐性

DREB(dehydration responsive element binding)转录因子通过调控下游多个抗逆相关基因表达, 有效提高植物的抗逆性. 利用酵母单杂交技术从大豆(Glycine max)品种吉农27的cDNA表达文库中克隆了一个新的GmDREB基因. 该基因编码174个氨基酸, 具有一个由58个氨基酸组成的AP2/EREBP保守域, 其中第14与第19位保守氨基酸分别是缬氨酸(V)与谷氨酸(E), 在N末端和C末端分别有一个核定位信号区和转录激活区. 利用玉米组成型启动子Ubiquitin和拟南芥诱导型启动子rd29A构建了植物表达载体, 通过基因枪转化小麦品种鲁麦22号, 获得103株T₀代再生植株, 通过PCR检测, 分别获得含Ubi::GmDREB和rd29A::GmDREB的转基因植株13株和11株. T₁代经过PCR, Southern blot, RT-PCR检测, 证明GmDREB基因已经整合到小麦基因组中, 并在转录水平上表达. 携带Ubi::GmDREB或rd29A::GmDREB转基因株系的T₁代植株苗期耐旱或耐盐性鉴定表明, 转基因小麦植株的耐旱或耐盐能力明显提高, 说明GmDREB基因在2种不同启动子驱动下均能有效提高转基因小麦的耐盐、耐旱性.     

病毒诱导的烟草DHS基因的沉默

将本生烟草(Nicotiana benthamiana) DHS (deoxyhypusine synthase, 脱氧羟腐胺赖氨酸合酶)基因的cDNA片段插入到马铃薯X组病毒(PVX)载体中, 构建重组病毒载体PVX-NbDHS. 通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统, 抑制本生烟草DHS基因表达. 感染植株表现为生长增强、叶片叶绿素含量下降、叶片衰老延缓和开花推迟. 半定量RT-PCR和Northern blot结果表明, PVX-NbDHS-VIGS植株中DHS mRNA丰度显著下降. Western blot检测表明, DHS靶蛋白eIF-5A的表达量与DHS呈平行下调变化. 综合分析植物表型和相应基因表达水平, 可以推断DHS在植物生长与发育中起重要作用.     

一种基于电化学发光技术的高灵敏度PS-1基因点突变检测方法

电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)分析是20世纪90年代初发展起来的一种高灵敏度检测方法, 它将电化学法和化学发光法巧妙结合, 利用金属钌的复合物和三丙胺在电极表面发生氧化还原反应而产生高效、连续、稳定的发光, 具有灵敏、快速、准确、操作简便和分析适应性广等特点, 已被应用于核酸的定量分析之中. 将电化学发光技术应用于基因点突变检测, 采用了一种基于PCR技术和限制性内切酶技术的电化学发光分析方法检测Presenilin-1基因(简称PS-1基因)密码子235处发生的点突变. 结果显示, 在PCR循环次数相同的条件下, 野生型样品酶切前后的电化学发光信号强度基本保持不变; 突变型样品酶切前后的电化学发光信号强度变化显著. 该方法可明显区分野生型样品和突变型样品, 可望用于老年性痴呆病的早期诊断.     

利用病毒诱导的基因沉默技术研究一个豌豆PI同源基因的功能

在植物发育生物学研究中, 对很多非模式植物基因功能的研究总是因为缺乏快速有效的方法而受到限制. 病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术是近年来发展起来的一种反向遗传学快速研究基因功能的方法. 本研究利用一种基于PEBV (pea early browning virus)的VIGS体系研究了豌豆PsPI基因的功能. 豌豆在其PsPI基因沉默后出现了类似于拟南芥pi突变体/金鱼草glo突变体的表型, 导致花瓣向萼片以及雄蕊向心皮转变. 半定量RT-PCR分析发现, 在VIGS-PsPI沉默植株花苞中, PsPI基因的mRNA水平显著下降. mRNA原位杂交结果显示, PsPI基因早期在起始共同原基的部位表达, 后期在花器官第二、三轮表达. 本研究结果证明了PsPI基因具有拟南芥PI/金鱼草GLO同源基因的功能, 说明这类基因在进化和功能上是相当保守的, 同时也表明VIGS是一种研究植物基因功能的快速有效的方法, 特别是对于那些转化困难的非模式植物基因功能的研究具有更为重要的意义.     

阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析

为研究具有广谱拮抗活性的阴沟肠杆菌B8的拮抗机理, 应用自杀性质粒pZJ25, 将Tn5转座到B8的染色体上, 筛选到2株拮抗活性丧失的菌株. 选择其中B8F突变株, 应用Tn5上的Kan^r基因作为标签, 对Tn5插入位点右侧的拮抗活性相关基因片段进行了克隆, 筛选得到质粒pTLF, 经亚克隆后测序, 获得F片段735 bp的序列. 提取原始菌株B8基因组DNA, 酶切后与PstⅠ接头连接, 应用接头引物和根据F片段设计的特异引物, 在F片段的左右两侧进行染色体步行, 获得了F片段(Tn5插入位点)左侧的1106 bp序列和F片段右侧的664 bp序列. 生物信息学分析显示, 获得的B8菌株拮抗相关基因序列包含3个ORF, 与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(基因GenBank登录号AY192157)有较高的同源性, 分别对应于admM, admN和admO共3个基因. 被Tn5插入破坏的ORF(命名为anrF基因)对应于admM (Polyketide 合酶基因), 插入位点位于终止密码前214 bp处. 由此证明, anrF基因与B8菌株的拮抗活性相关, 推测B8菌株产生的拮抗物质为andrimid.     

一个新的水稻卷叶突变体rl9(t)的遗传分析和基因定位

对水稻中调控形态发育的基因进行发掘和研究是进行水稻株型改良和植物生长发育分子生物学研究的重要基础研究工作. 本研究在粳稻中花11中鉴别了一个新的卷叶突变体, 并对其进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该卷叶突变体是由一隐性单位点(rl_9(t))控制, 利用SSR标记已经把Rl_9(t)定位在水稻第9染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在Rl_9(t)附近区域发展了30个新的STS标记, 对Rl_9(t)进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖Rl_9(t)区域的PAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约42 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

稻瘟病菌新无毒基因AvrPi7的遗传及物理作图

稻瘟病是目前最具毁灭性的作物病害之一. 本研究通过由田间菌株CHL346和CHL42杂交得到的189个子囊孢子菌株构建的分离群体, 在亲本菌株CHL346中鉴定到了与水稻稻瘟病抗性基因Pi7对应的无毒基因AvrPi7. 为了确定AvrPi7位点的染色体位置, 本研究开发了一套基于稻瘟病菌测序菌株70-15全基因组序列的121个微卫星(simple sequence repeat, SSR)标记. 利用这些SSR标记对AvrPi7位点进行了连锁分析. 结果表明, 位于第1染色体的8个SSR标记与该无毒基因连锁, 其中2个最近的侧翼标记MS1-9和MS1-15分别距离AvrPi7位点3.2和16.4 cM. 为了进一步完成该位点的精细作图, 在MS1-9和MS1-15的侧翼区域进一步开发了8个SSR标记和3个候选无毒基因(candidate avirulence gene, CAG)标记. 通过对这些标记的连锁分析, AvrPi7位点被界定于标记MS1-21和MS1-22之间1.6 cM的区域内, 并与标记CAG2共分离. 为了构建该无毒位点的物理图谱, 通过生物信息学分析(bioinformation analysis, BIA), 将与该基因连锁的分子标记分别着陆于参考菌株70-15的超重叠群(supcontig)上. AvrPi7位点最终被界定在标记MS1-21和MS1-22之间的75 kb区段内. 本研究的结果对于进一步了解真菌中普遍存在的重组不平衡和部分二倍体等现象, 以及对该基因进行克隆及其功能研究具有重要意义.     

水稻不完全隐性卷叶主基因rl(t)的精细定位

利用奇妙香(QMX)为轮回亲本, 与卷叶珍汕97B(JZB)杂交并回交的BC₄F₂和BC₄F₃两群体为研究材料, 对卷叶性状进行了遗传分析, 并对卷叶基因进行精细定位. 遗传分析表明, 卷叶性状主要受1对不完全隐性主基因的控制, 命名为rl_(t), 并同时受到数量性状基因和或环境的影响. 利用500个SSR标记和新开发的15个InDel标记, 通过BSA法在卷叶DNA池和平展叶DNA池间筛选到8个多态性标记, 并用MAPMAKER/EXP3.0构建遗传连锁图. 基因定位方法采用复合区间作图法(CIM). 利用BC₄F₂分离群体将rl_(t)初步定位于第2染色体长臂, 位于标记InDel 112~RM3763之间, 两标记之间的遗传距离为2.4 cM, rl_(t)距离InDel 112约1.0 cM. 为精细定位rl_(t), 从BC₄F₂代经标记选择得到1个中度卷叶植株, 自交扩繁成855株个体的BC₄F₃代株系, 另发展4个新的InDel标记. 连锁分析表明, InDel 112.6和InDel 113位于标记InDel 112和RM 3763之间. 利用BC4F3株系中分离出的191个卷叶株和185个平展叶株, 将rl_(t)定位于InDel 112.6~InDel 113之间, 物理距离为137 kb. 对该区段进行了初步的侯选基因分析, 推测rl_(t)可能参与了microRNA(miRNA)系统对叶片发育的调控.     

phbB基因在莱茵衣藻中的表达与分子检测

通过构建依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)的衣藻表达载体, 用石英砂VOTEX转化技术, 将phbB基因导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii cc-849)中, 用含有10 μg/mL的Zeomycin的平板培养基进行筛选和实验室保持培养, 得到了表达phbB基因的转基因藻株. PCR和Southern blot结果显示phbB基因已整合到莱茵衣藻基因组中. RT-PCR与DNA杂交的检测结果显示, 导入的phbB基因在衣藻中具有转录活性.     

水稻散生突变体的遗传和基因定位研究

分蘖角度是构成水稻理想株型和高产育种的重要农艺性状之一. 通过对水稻散生突变体的遗传学分析认为, 该散生表型受一隐性核基因控制, 与已报道的水稻散生突变体la等位, 故将此突变体命名为la-2, 而原突变体被重新命名为la-1. 利用la-2与w11和浙福802分别杂交产生的F₂群体对LA位点进行遗传定位, 发现其与第11号染色体上的微卫星标记RM202和RM229连锁, 遗传距离分别为10.0和8.0 cM. 通过进一步在两标记间发展的6个新的分子标记, 将该基因精确地定位于约0.4 cM的区间. 为进一步克隆LA基因和探讨水稻分蘖角度的控制机制奠定了良好的基础.