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通过定点突变及基因替代技术, 将肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)野生型菌株的固氮酶钼铁蛋白α亚基中铁钼辅因子(FeMoco)周围多肽链的Glnα190和Hisα194分别置换为Lys和Gln, 并构建成2个单突变株,命名为Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q. 将上述2个突变分别引入Kp-nifV突变株(与FeMoco相连接的高柠檬酸被柠檬酸置换)获得另外2个双突变株, 命名为Kp-Qα190K-nifV8722;和Kp-Hα194Q-nifV8722;. 对上述4种突变株进行诱导培养和细胞的固氮酶活性分析表明, 4种突变株都失去了固氮活性, 乙炔(C2H2)还原活性也大幅度降低, Kp-Qα190K单突变株的乙炔还原活性比Kp-Hα194Q单突变株下降得多; Kp-Qα190K-nifV8722;双突变株几乎完全丧失了活性, 而Kp-Hα194Q-nifV8722;野生型菌株10%的乙炔还原活性. 突变株将氘代乙炔(C2D2)还原成氘代乙烯(C2D2H2)的情况是: Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q-nifV8722;突变株的C2D2还原产物中, 反式-1,2-二氘代乙烯比例比Kp野生型增加了1倍, 表明固氮酶催化加氢的立体构型选择性降低. 以上结果表明, 固氮酶活性中心周围多肽环境中Glna190残基, 及与FeMoco相连的高柠檬酸, 可能直接参与质子和/或电子向活性中心FeMoco的传递. 推测Glna190和与FeMoco的Mo原子相连的高柠檬酸, 在质子和/或电子通过Mo位进入FeMoco起关键作用. 这种双突变株所产生的固氮酶, 有利于在体外研究固氮酶的催化机制, 可以通过分析用于还原底物的电子和质子进入活性中心FeMoco的位点, 推测出底物在活性中心中的络合和还原的部位. 相似文献
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阿维菌素B产生菌寡霉素合成阻断株的构建 总被引:4,自引:2,他引:4
以仅产阿维菌素(avermectin) B和寡霉素(oligomycin)的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)CZ8-73为出发菌株, 构建基因缺失载体pXL05(pKC1139∷ΔolmA1 + ΔolmA4), 并将其转入CZ8-73中, 通过缺失质粒和染色体之间的同源双交换, 对染色体上长达90 kb的寡霉素PKS基因簇(olmA)进行了缺失突变. 将4株经Southern杂交验证正确的基因缺失突变株进行摇瓶发酵和HPLC检测, 发现4个突变株均不再产生寡霉素而仅产阿维菌素B组分, 阿维菌素的总产量和B1的产量与出发菌株相当, 说明寡霉素PKS基因簇的缺失并不影响阿维菌素的生物合成. 该缺失突变是在染色体上通过同源双交换完成的, 不会发生进一步的重组, 因此突变株性状稳定, 在工业生产上具有应用价值. 相似文献
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基于前期对固氮酶催化过程中存在两条电子传递通路的推论,探索从与P原子簇共价相连的β-93Cys出发至FeMoco之间重要的氨基酸位点.通过分析固氮酶钼铁蛋白的结构,利用体外定点突变和基因替代技术,将产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)固氮酶β-102Asn,α-431Lys和α-423Ile位点分别替换为β-102Ala,α-431His和α-423Pro,获得Nβ102A,Kα431H和Iα423P突变株.3个突变对细菌固氮生长有不同程度的影响,其中Iα423P突变株几乎无固氮生长,细胞乙炔还原活性显著下降;在42 L发酵罐中培养,其细胞最高固氮酶活性仅为野生型菌株的1/6;qRT-PCR检测发现此突变株nifD基因4倍的上调表达.分离纯化Iα423P钼铁蛋白,其最高C2H2和H+还原水平分别为野生型的13%和21%.根据以上研究结果推论,突变固氮酶的催化活性显著降低,或与直接打破α-423Ile与高柠檬酸长臂之间的氢键有关,推测α-423Ile是固氮酶催化底物还原过程中,电子经高柠檬酸长臂进入活性中心Mo位的入口氨基酸. 相似文献
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耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI缺陷性突变和功能补偿性突变株的建立 总被引:1,自引:3,他引:1
PprI是近来在耐辐射球菌Deinococcus radiodurans中发现的一个极其重要的DNA修复开关基 因. 以已测序的野生型菌株R1为材料, 运用PCR突变法将克隆具有自身GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段反向重组到pprI基因中去, 首次获得了卡那霉素抗性的、pprI功能完全破坏的突变株YR1. 辐射细胞生存率结果表明, YR1对辐射异常敏感. 另外, 将含有GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段重组到质粒pRADZ3中, 获得了具有卡那霉素抗性的表达质粒pRADK; 再将体外克隆的具有pprI完整基因和C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段分别重组到pRADK中. 研究结果表明, 含有pprI完整基因的表达质粒在YR1中能够正常表达, 并完全恢复到野生型的极端抗性; 而C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段虽能在YR1中正常表达, 但对辐射异常敏感, 不能恢复其极端抗性. 上述pprI基因功能缺陷性和功能补偿性突变株的建立, 为深入研究细胞体内PprI蛋白质的定位、结构域与功能的关系, 以及原位研究PprI蛋白质的理化特性提供了十分有效的方法 相似文献
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深红红螺菌draTGB hupL双突变株在不同光照条件下的放氢 总被引:2,自引:0,他引:2
为提高深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)在两阶段培养条件下的放氢量, 分别构建了缺失吸氢酶大亚基基因hupL的单突变株R. rubrum UR801和缺失固氮酶活性调节因子基因draTGB与hupL的双突变株R. rubrum UR805. 对比测试了这两个突变株与野生型菌株R. rubrum UR2和UR472 (ΔdraTGB)在不同光照条件下的放氢量. 结果表明, 在持续光照条件下, R. rubrum UR801的氢产量最高, 可达5700 mL/L, 分别为R. rubrum UR2, UR472和UR805氢产量的1.56, 2.24和2.32倍; 而在两阶段培养条件下, R. rubrum UR805的氢产量最高, 可达4303 mL/L, 分别为相同条件下R. rubrum UR2, UR801和UR472氢产量的1.35, 1.21和1.04倍. 据此, R. rubrum UR805有望作为两阶段培养条件下大量放氢的菌株. 相似文献
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柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)和鱼腥藻7120(Anabaena 7120)(均为蓝藻植物)在空气中均能固定分子态氮.我们用紫外线和亚硝基胍分别对它们进行诱变、筛选,获得二株具异形胞而不能在空气中固定分子态氮的突变种.鱼腥藻-1(Anabaena-1)是鱼腥藻7120经紫外线诱变后得到的突变种,而鱼腥藻-2(Anabaena-2)是柱孢鱼腥藻经NTG诱变后获得的突变种.它们的异形胞频率(10~17.5%)高于野生种(5~9%).经二年多的连续传代培养表明突变表型是稳定的,自发回复突变频率很低(分别为1×10~(-8)和1.9×10~(-6).在微氧条件下能 相似文献
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利用mini-Tn5 lacZ2对磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense) MSR-1进行转座插入突变, 获得磁小体缺失突变株NM21. 通过锚定PCR从NM21中克隆出Tn5插入位点的侧翼序列, 获得长3073 bp的DNA片段, 其中含有3个ORF, Tn5插入在ORF1中, 互补实验证明该片段与磁小体合成相关. 对ORF1编码的蛋白进行同源比较和功能分析, 发现ORF1编码的蛋白中部有4个跨膜螺旋, 与其同源性较高的序列全部为二价阳离子转运蛋白. BLAST软件分析表明, ORF1编码的蛋白具有COG0053和PRK09509结构域, 与FieF和MMT1等二价阳离子转运蛋白家族CDF (cation diffusion facilitator)有相同的结构域, 推测其为磁小体膜上Fe2+的转运蛋白, 且可能在去除Fe2+对细胞毒害的过程中起着重要作用. 相似文献
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大肠杆菌(Escherichia coli)质膜上的质子ATP酶(H~+-ATPase)由F_1、F_0二部分组成,纯化的F_1ε亚基对F_1有很强的抑制作用,但在重组F_1F_0中似乎不显现抑制作用。1986年Gibson实验室分离到一种ε亚基突变株,并得到二种部分回复突变株,实验结果表明,突变株中的F_1F_0仍能形成,但水解活力及跨膜质子传递能力均下降,而在部分回复突变 相似文献
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我们知道,所有DNA的核苷酸的自然突变,皆由天然放射线、化学作用物质等的作用与细胞内复制酶系对DNA的作用平衡而产生.而对任何物种来说,必然有一个由这平衡作用所产生的全突变概率(V_T).也就是说,全突变概率可以是有利突变、中性突变或有害突变(概率). 根据病毒及细菌基因编码的研究,一个有功能基因似可分为三种类型. 相似文献
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选择条件下细菌突变的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本文论述了细菌在选择条件下适应性突变研究的新进展 .对通常认为的适应性突变具有的特征 (适应性突变的方向性 ,时间依赖性和细胞生长非依赖性 )进行了辨析 .指出了非致死的选择条件下 ,细菌有利突变高频率发生这种现象 ,并不是选择条件诱导的定向的适应性突变 ,它的发生与选择条件之间没有直接的相关性 ;选择条件下突变发生的时间依赖性 ,并不是适应性突变所特有的 ,自发的随机突变也表现时间依赖性 ;而且突变的发生也是随机的 ,需要依赖于细胞生长和分裂 ,与自发突变没有本质上的区别 .选择条件下有利突变高频率发生的原因 ,可能是细菌在选择条件下自发突变率提高和选择条件造成含有利突变的细胞优势生长的综合作用的结果 .此外 ,还指出了Cairns等提出适应性突变假说时所依据的数学分析方法的错误 . 相似文献
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不稳定三核苷酸重复序列的动态突变是导致人类遗传病的一种新突变类型.迄今已发现脆性X综合征(FraX),脊髓延髓肌萎缩(SBMA),肌强直性肌萎缩(DM),亨廷顿舞蹈病(HD),脊髓小脑共济失调Ⅰ型(SCAl),精神发育迟缓(FraXE),齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(DRPLA)和马赫多约瑟夫病(MJD)等8种遗传病与动态突变有关.这一新突变机制的发现阐明了早现的分子机制,提供了简便有效的DNA直接诊断方法,同时也提出了许多新问题,成为当前遗传学、生物化学、分子生物学和神经生物学研究的一个新热点. 相似文献
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定位突变作为基因工程和蛋白质工程研究中的一种基本方法,已广为应用。定位突变法可利用噬菌体M_(13)单链DNA作为基因载体,在化学合成的寡聚核苷酸引物的诱导下,把碱基突变导入基因的任何预定位置。但经典的方法常常需要通过碱性蔗糖梯度离心、凝胶电泳等耗时而复杂的手段富集经体外诱变的闭环双链DNA,突变基因的产率一般较低,且只进行碱基的单点突变。因此,当某些基因需要进行间隔一段距离的多点突变时,用此法逐一改变碱 相似文献
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从棕色固氮菌缺失nifE的突变株DJ35中纯化得到纯度约为80%的MoFe蛋白(ΔnifE Av1). 与野生种OP中纯化出的MoFe蛋白(OP Av1)相比, ΔnifE Av1具有与之相同的亚基组成, 并可与OP Av1的抗体发生免疫交叉反应, 但在厌氧天然电泳中的迁移率略大于OP Av1. 金属含量测定表明, ΔnifE Av1的Mo和Fe含量均显著下降. ΔnifE Av1单独与OP Fe蛋白互补时不具乙炔还原活性, 但可被从OP Av1中抽提出的FeMo-co体外激活. ΔnifE Av1的圆二色谱450 nm附近区域与OP Av1的相似, 而电子顺磁共振谱中g ≈ 3.7的信号则完全消失, g ≈ 4.3和2.0处的信号也分别下降75%和50%左右. 上述结果表明, 从DJ35中纯化出的ΔnifE Av1是一种FeMo-co缺失而P-cluster正常的MoFe蛋白. 相似文献
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大肠杆菌核糖体蛋白质L24基因(rplX)的一个新的点突变 总被引:1,自引:0,他引:1
大肠杆菌核糖体蛋白质 L24是核糖体50S 大亚基组装的起始蛋白质之一.L24蛋白质发生突变或缺失对细菌的生长速度和细菌体内50S 亚基的含量都有很大影响.本实验室曾报道在一株 L24突变体 T83(rplX)中,λN 基因的表达受阻,λQ 基因的表达基本正常,同时,λN 基因的 mRNA 合成正常,说明λN 基因表达是在翻译水平上受到了抑制.本文通过DNA 顺序分析确定了该 rplX 突变发生的位置是一个 GGT 密码子突变成了 GAT 密码子, 相似文献
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黄淑帧周霞娣朱皓任兆瑞曾溢滔 《科学通报》1989,34(17):1358-1358
β-地中海贫血是我国常见的一种遗传性单基因病。目前世界上已发现60多种不同类型的β-地中海贫血基因,而每一民族和群体具有其特定的突变类型。因此开展对β-地中海贫血突变及其分布的研究对阐明疾病的发生、民族的关系、人群的迁涉以及对β-地中海贫血的防治等均具有十分重要的意义。本文报告用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)体外DNA扩增法结合寡核苷酸分子杂交技术,鉴定和分析了来 相似文献