体外培养时间和表皮生长因子对牦牛卵母细胞成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

研究在成熟液中添加表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）以及成熟时间对牦牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响,以确立牦牛卵母细胞体外成熟的最佳体系.结果表明,成熟液中添加EGF组的成熟率明显高于未添加组（P＜0.05）,并且牦牛卵母细胞的成熟率随着EGF添加的浓度增加也不断上升;随着体外培养时间的延长,成熟率逐渐增加,培养24 h后成熟率趋于稳定;胚胎体外培养液中添加EGF能显著提高孤雌胚胎的8-细胞和囊胚形成率（P＜0.05）.由此推测：在体外培养22-24 h,且添加40 μg/mL EGF最有利于牦牛卵母细胞体外成熟;胚胎培养液中添加40μg/mLEGF能显著提高牦牛孤雌胚胎的体外发育能力.     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育的比较

目的对MII期水牛卵母细胞进行人工诱导激活,可以间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,并且,卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一。比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较。结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27 h或30 h的囊胚发育率(19.0%,17.7%)明显高于体外成熟21 h或24 h的囊胚发育率(12.3%,13.8%);Ion联合6_DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同培养条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚(21.7%,13.0%)。     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.     

牦牛,黄牛体外受精比较和分割胚的移植

采用常规方法对黄牛和牦牛卵母细胞的体外受精技术进行初步探索.实验采用相同的成熟液、受精液和培养液,并且两种卵母细胞成熟后均以黑白花冷冻精液进行受精.成熟培养时间为22～26.h.受精后48h移入颗粒单层培养滴中,第6、7、8天记录囊胚发育情况.结果表明：来自屠宰场的不同品种的卵巢在提供卵母细胞的数量上无显著差异（P＞0.05）.50个黄牛卵巢获得344枚可用卵母细胞、回收率为6.9枚／卵巢;30个牦牛卵巢获得206枚可用卵母细胞,回收率为69：16个黄牛加28个牦牛卵巢获得373枚可用卵母细胞,回收率为7.5受精后黄牛、牦牛的卵裂率（69.2％比44.1％）差异极显著（P＜0．01）而囊胚发育率（31.8％比25.0％）差异显著（P＜0.05）牦牛与黄牛卵母细胞共同培养时其卵裂率和发育率比较接近黄牛卵母细胞的发育水平（分别为61、2％和30.5％）挑选部分黄牛杂交胚胎进行分割实验,将其中的四对半胚非手术移入4头发情同步的受体牛．两个月直肠检查有3头妊娠（75％）,其中有两头受体足用分娩,其－产奶黄杂公犊－头,另－受体产一对奶黄杂双胎、－活－死（畸胎）实验表明：常规的体外受精技术用于牦牛是可行的,但其中仍有－些值得改进的地方,另外完全体外化的胚胎分割技术为提高优质良种胚胎的生产效率提供了便捷     

瘦素对猪卵母细胞体外成熟及克隆猪妊娠率的影响

体细胞克隆猪在人类医学、基础科学研究和畜牧业生产方面均具有很大的应用潜力.为了提高体细胞克隆猪的效率,首先比较了两种基础成熟液NCSU-23和TCM199的体外成熟效果,然后在TCM199培养液的基础上,较系统地研究了添加不同浓度的瘦素对猪卵母细胞成熟、孤雌激活胚胎和克隆胚胎的体外发育以及克隆胚胎体内发育的影响.结果表明:成熟液中添加100ng/mL或200ng/mL瘦素对猪卵母细胞的核成熟没有显著影响(P>0.05);对孤雌激活卵裂率和克隆胚胎卵裂率也没有显著影响(P>0.05);但却显著提高了孤雌激活胚胎的囊胚率和囊胚细胞数,并且显著提高了克隆胚胎的囊胚率;当添加量为100ng/mL时,克隆囊胚的细胞数显著升高.另外,研究表明,瘦素很可能具有提高克隆胚胎移植妊娠率和妊娠到期率的作用.     

猪早期孤雌胚胎脂滴含量和脂肪酸代谢相关基因表达的初步研究

作为能量来源,脂质在卵母细胞成熟、胚胎发育和干细胞增殖中发挥着重要作用,猪卵母细胞和早期胚胎中存在丰富的脂质,但是其脂肪酸代谢的作用机制还知之甚少.本研究通过统计卵母细胞的成熟率和体外受精的囊胚率,确定添加10%卵泡液是最优的卵母细胞成熟体系.通过检测电激活、电激活结合CB和9%乙醇分别作用3min、8min、11min等对卵裂率和囊胚率的影响,确定电激活(卵裂率为81.69%±0.41%,囊胚率为26.45%±0.28%)方式是最优的孤雌激活方案.免疫荧光染色显示孤雌囊胚的细胞核数目明显少于体外受精囊胚,对孤雌胚胎进行脂滴染色和脂滴含量检测的结果显示,脂滴定位于核周围,H2Av只存在于细胞核内,不存在于脂滴中,8-细胞时期脂滴直径达到最大,而桑椹胚中脂滴含量最高.对脂肪酸代谢相关基因的RT-PCR结果显示,与卵母细胞相比,FAS等基因表达量呈在胚胎发育各个时期呈上升趋势,ACADM等基因表达量呈下降趋势.本研究为深入了解脂肪酸代谢在早期胚胎发育过程中的作用机制奠定了基础.     

生长因子对猪卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育的影响

主要探讨了三种生长因子对猪卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育及多能基因表达的影响,结果表明:成熟液中添加生长因子后可显著提高卵母细胞成熟率;成熟液和发育液中都添加生长因子后胚胎卵裂率、囊胚率及胚胎质量均显著升高;添加生长因子可极显著提高孤雌囊胚中多能基因的表达.本研究为提高猪卵母细胞成熟及胚胎早期发育奠定了基础,进而为获得更利于分离培养猪胚胎干细胞系的囊胚材料提供了参考.     

小鼠孤雌生殖的胚胎干细胞的初步研究

比较去透明带孤雌桑葚胚和留透明带孤雌囊胚、体内受精胚胎、体外受精胚胎在饲养层上囊胚的扩张率、岵壁生长率．结果表明去透明带孤雌桑葚胚比留透明带孤雌囊胚的扩张率显著（p〈0．05）提高，而贴壁率则极其显著地（p〈0．01）提高，此外前者还发生增殖．但孤雌胚胎的囊胚扩张率、贴壁率和增殖率均极其显著地（p〈0．01）低于体内受精胚胎和体外受精组；体内受精胚胎的体外发育最佳．说明去透明带孤雌桑葚胚比留透明带孤雌囊胚更利于在饲养层上贴壁生长，为建立孤雌生殖的胚胎干细胞系提供了基础．     

猪卵母细胞第一极体排出与否对其早期胚胎发育的影响

探讨猪卵母细胞第一极体排出与否对其体外受精和孤雌激活后早期发育的影响．从屠宰场收集猪卵巢卵母细胞,体外成熟培养42-46h后分为3组：排出第一极体组、没有排出第一极体组和对照组（不挑选第一极体卵母细胞）,进行体外受精或化学孤雌激活之后放入胚胎培养液进行体外培养,分别于第48h和第168h统计分裂率和囊胚率．①体外受精后,有极体组的卵裂率略高于无极体组和对照组的卵裂率（62．19％&#177;6．99％vs55．40％&#177;6．80％和56．33％&#177;8．17％）,各组间没有显著差异（P〉0．05）;囊胚率分别为4．87％&#177;3．77％,2．33％&#177;1．34％和3．50％&#177;2．96％,有极体组明显高于无极体组（p〈0．05）,对照组与其它两组没有显著差异（p〉0．05）．②化学激活后,有极体组的卵裂率高于无极体组和对照组（75．45％&#177;1．35％vs64．81％&#177;2．07％和69．64％&#177;2．51％,p〈0．05）;有极体组的囊胚率也高于无极体组和对照组（24．54％&#177;4．34％vs12．96％&#177;3．99％和18．75％&#177;1．87％,p〈0．05）．排出第一极体卵母细胞比没有排出第一极体卵母细胞的发育能力强,但没有排出第一极体卵母细胞经体外受精或人工激活后也可以发育到囊胚阶段．     

不同化学激活方法对小鼠卵母细胞孤雌激活效果的影响

通过比较几种常用的化学激活方法对小鼠卵母细胞的孤雌激活和孤雌生殖胚胎体外发育的影响,从而筛选出小鼠卵母细胞孤雌激活的适宜方法.选取成熟小鼠卵母细胞,随机分为以下9组进行激活处理:①离子霉素(I)+6-二甲氨基嘌呤(D);②I+D+细胞松弛素B(CB);③I+放线菌酮(C);④I+C+CB;⑤φ(乙醇)=7%的乙醇(E)+D;⑥E+D+CB;⑦E+C;⑧E+C+CB;⑨Sr2++CB.比较了这9种化学激活方法以及SrCl2的作用时间和卵龄对小鼠卵母细胞激活效果的影响.实验结果表明:小鼠卵母细胞孤雌激活率与激活措施和卵龄有关;小鼠卵母细胞可以被I+D+CB或SrCl2+CB有效激活,激活率及孵化囊胚发育率均高于其他激活方法(P0.05),且以SrCl2+CB最为有效.hCG注射后20h为小鼠卵母细胞进行SrCl2激活的最适卵龄,其最佳处理时间为4h.对小鼠卵母细胞而言,6-DMAP比放线菌酮的激活效果好.