研究G偶联蛋白受体G2A功能特定细胞模型的建立

通过克隆人质子感知受体G2A基因、构建G2A基因的表达载体并瞬时转染293T细胞,建立G2A受体调控机理及其功能研究的转基因细胞模型,并检测G2A介导的细胞应答.从人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)中提取总RNA,反转录为cDNA为模板,设计一对针对G2A基因的引物,克隆不含终止密码子的G2A基因并亚克隆到pMD-19T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体pEGFP-N3用HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pEGFP-N3-G2A,并测序鉴定;重组载体以lipofectamine2000介导转染293T细胞.Real time PCR法检测外源基因在293T细胞中的表达;ELISA检测转染与未转染G2A基因的细胞内三磷酸肌醇(Inositol-1,4,5-triphosphosate,IP3)的含量.测序和酶切证实了克隆到G2A基因并获得pEGFP-N3-G2A表达载体;荧光成像与Real time PCR证实在293T细胞中过表达G2A基因;ELISA检测在酸性刺激下转基因细胞内IP3含量(应答)明显升高,而脂质配体LPC则抑制其IP3的积累,本研究为G2A受体介导信号机制及其功能研究提供一个真核细胞模型.     

A novel human gene spindlin1, encoding a protein localized in the cell nucleus and inducing NIH3T3 cell''s transformation

A novel human gene, spindlin1, recently cloned in our laboratory, is highly expressed in the tissue of ovary cancer. To study its biological function, a vector expressing green fluorescent-spindlin1 fusion protein was constructed and transfected into COS-7 and NIH3T3 cells by lipofectamine methods. The results showed that the fusion protein pEGFP-N1-spindlin1 was localized in the nucleus of COS-7 and NIH3T3 cells. NIH3T3 cells which could stably express spindlin1 as a result of RT-PCR analysis compared with the parental NIH3T3 cells displayed a complete morphological change, improved the cell growth and increased the percentage of cells in G2/M phase (12.6% vs control cells at 3.4%). Furthermore, overexpressed spindlin1 cells formed colonies in soft agar, more motile in migration assay in vitro and formed tumors in nude mice. Our findings provide direct evidence that spindlin1 gene may be a prooncogene which is associated with tumorigenesis.     

人endostatin基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中表达

为探讨转人血管内皮抑制基因（endostatin）在转染细胞中的表达，利用逆转录病毒载体构建人endostatin基因的重组质粒，通过脂质体（lipofectamine）将重组质粒导入包装细胞PA317,制备重组病毒液。用重组病毒液感染NIH3T3细胞，经G418筛选获得转入endostatin基因细胞株NIH3T3-endo。同法制备对照细胞株NIH3T3-pLncx.PCR检测NIH3T3-endo细胞基因组，在扩增产物中一份550bp人endostatin基因特异性片段，对照组为阴性。免疫组化测定示仅NIH3T3-endo细胞中有外源性endostatin蛋白的表达，说明人endostatin基因已被成功导入NIH3T3细胞，并获得稳定表达。     

人spindlin 1基因全长cDNA的克隆与定位

利用分子克隆技术和生物信息学手段,克隆并命名了人spindlin 1 基因. 此基因cDNA全长4375?bp,含有236～949 bp完整开放读框,预测编码27?ku 的膜内蛋白. 新基因在核酸序列上与鼠spindlin基因有96%同源,其编码氨基酸序列与鼠spindlin蛋白98%同源. 生物信息学分析表明该基因定位于9q22.1-22.3 区域, 基因组DNA全长为52.3?kb,由5个外显子和4个内含子组成,内含子和外显子之间的剪切完全符合GT-AG法则. 利用绿色荧光蛋白与spindlin 1基因的融合蛋白表达载体转染COS-7细胞表明spindlin 1表达的蛋白定位于胞核,且转染后的细胞中较多见胞核形态的改变,例如出现双核或巨型核.     

增强型绿色荧光蛋白表达对鼠C6细胞生物学特征影响的研究

脂质体包裹质粒pEGFP-N1转染C6细胞,经G418筛选,得到稳定表达绿色荧光的C6-EGFP细胞.细胞计数,MTT,流式细胞术分别测定C6细胞在转染绿色荧光蛋白后增殖性,细胞活力以及细胞周期等生物学特性.C6细胞在转染了绿色荧光蛋白基因后细胞增殖性降低,细胞活力降低,细胞周期也发生了一些改变.     

LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究

【目的】构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞293T,通过Earle's盐平衡液(Balanced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象。【方法】RT-PCR扩增LC3基因,并将其插入pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒。将重组质粒转染至人胚肾细胞293T,显微镜观察、Western blot检测GFP-LC3融合蛋白表达情况。对转染细胞进行Earle's盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成。【结果】成功构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并在293T细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot检测到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。【结论】本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材。     

Fractalkine基因真核表达质粒的构建及其在小鼠肝癌细胞中的表达

为克隆小鼠趋化因子Fractalkine(．FK)基因，构建真核表达质粒，并在小鼠肝癌细胞中表达，用以进行肿瘤的基因治疗，用RT-PCR法，从小鼠乳腺癌细胞D2F2扩增FK的cDNA，插入pCR2．1 TOPO载体，测序证实后，将其亚克隆至质粒pIRES中构建FK真核表达载体；用脂质体将重组质粒转染小鼠肝癌MM45 T．Li细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，用RT-PCR和免疫化学方法鉴定转染细胞中FK基因的表达．结果表明：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT-PCR和免疫化学方法证明转基因MM45T．Li细胞克隆中存在小鼠FK基因的表达。     

结核分枝杆菌ESAT6基因真核表达载体的构建及表达

为了研究结核杆菌毒力因子ESAT6在结核杆菌感染细胞过程中的功能。采用分子生物学方法,根据Gen-Bank中登录的结核杆菌H37Rv的ESAT6基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到ESAT6基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将ESAT6基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6。用重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6转染293T细胞。结果显示:重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6测序结果正确,转染细胞后出现绿色荧光,经Western blot分析鉴定,可见约35kDa的预期蛋白条带,证实ESAT6-EGFP融合蛋白在293T细胞中获得了表达。研究结果为进一步研究毒力因子ESAT6在感染宿主细胞中所发挥胞内生存机制奠定了基础。     

用于电转染NIH3T3细胞的两种电击介质的比较

分别采用不含钙镁离子的PBS与电转缓冲液,利用电穿孔转染法将带有增强型绿色荧光蛋白(e GFP)的pe GFP-N1质粒转染到NIH3T3细胞中.所用的电转参数为:电压6 V,脉冲数2,脉冲时间1ms.结果表明,无钙镁的PBS的电转效率高达(21.2±2.1)%,而电转缓冲液的电转效率只有(3.8±1.4)%.在电转后加入G418筛选,用不含钙镁离子的PBS为电击介质的细胞状态正常且大量增殖.因此,通过对转染效率以及对细胞损伤的对比,无钙镁的PBS更适合作为NIH3T3细胞的电击介质.     

人Rab26基因的克隆和表达

以完整EST为参考序列设计引物,以人的胎脑cDNA为模板,用PCR方法筛选获得Rab26基因全长序列,并亚克隆到载体pGEM-T,真核表达载体pEGFP-N1和原核表达载体pET．32a（＋）中,RT-PCR显示该基因在不同组织的肿瘤细胞株中表达量有明显的差异．把Rab26基因转染入HeLa细胞中,通过与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达,显示Rab26定位于胞内膜性细胞器上．在大肠杆菌表达系统获得Rab26基因的高表达．这些结果为进一步研究Rab26基因在细胞内吞和运输功能等方面打下了基础．     

PI3K等5条信号通路对NIH3T3细胞周期进程的调节作用研究

为从基因转录水平解析信号通路对NIH3T3细胞周期进程的调控作用,用小鼠基因表达谱芯片Mouse Genome 4 302.0检测信号通路相关基因表达丰度发现,PI3K,STAT3,钙蛋白酶,Rho家族鸟苷酸激酶和VEGF等5条信号通路的105个基因在该细胞的细胞周期中发生有意义的表达变化.分析基因表达变化预示的信号通路作用表明,上述5条信号通路依次促进G1期、G1/S转换期、S期、G2/M转换期和M期进程.结论:上述5条信号通路促进NIH3T3细胞的细胞周期进程.     

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。经酶切和基因测序鉴定LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达。说明基因重组技术可成功构建LMP3／pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内。     

PARP抑制剂诱导外源整合基因删除的作用特点

构建能表达LacZ基因和c-Ha-T24ras基因的两种真核表达重组质粒A13.4和B12.7（两基因相对位置不同），并将其转染NIH3T3细胞和HeLa细胞，经G418筛选，分别建立了四种稳定转化细胞系A13.4-NIH3T3、B12.7-NIH3T3、A13.4-HeLe及B12.7-HeLa。用聚ADP核糖聚合酶（PARP）的NAD位点抑制剂苯甲酰胺（BA）分别处理四种转化细胞后，检测细胞中整合的外源LacZ基因与c-Ha-T14ras基因的删除情况，结果如下：BA诱导的基因删除可发生于NIH3T3转化细胞系，但不能发生于HeLa转化细胞系；位于同一外源表达载体上的LacZ基因与c-Ha-T24ras基因的删除过程是同步的；外源整合DNA片段的转录强度可能直接影响其被BA诱导删除的敏感性。     

人类肿瘤治疗实验研究

<正> 一个高转移的人肺巨细胞癌移植瘤PG已在无胸腺裸鼠体内建立。在各种遗传背景的裸鼠体内,包括BALB/cA、NIH、C57BL/6J、615/PBI等,PG肿瘤细胞皮下接种后,均可发生自发转移,局部淋巴结转移率为94％(110/117),肺转移率为83％(97/117)。这种高转移特性在五年多时间内连续100多代移植过程中仍保持不变。为了研究肿瘤转移的遗传机制,我们从PG瘤细胞中提取高分子量DNA片段,用磷酸钙共沉淀的方法转染NIH/3T3小鼠纤维母细胞。经过连续两轮转染,获得的转化细胞能在裸鼠体内成瘤。其中一个转化克隆TF87-2-10皮下接种裸鼠后,能自发转移至肺。DNA分子杂交显示该细胞基因组中整合有人DNA序列。说明该转化细胞转移表型的     

稳定转染Oct-4基因后人脂肪来源干细胞性状分析

观察了转染Oct-4基因对人脂肪来源干细胞性状的影响.首先将Oct-4基因全序列亚克隆至逆转录病毒载体pMSCVneo中,构建逆转录病毒重组质粒,然后以脂质体介导转染包装细胞PT67,成功建立PT67-Oct4细胞系,随后转染人脂肪来源干细胞(adipose-derived stemcells,ADSCs)中,最后对高表达Oct-4基因的ADSCs性状进行观察.实验结果表明,对高表达Oct-4蛋白的ADSCs-Oct4同未转染Oct-4的ADSCs相比,ADSCs-Oct4在形态学、表面标志、核型等方面无明显差别,接种ADSCs-Oct4细胞8周后裸鼠体内未形成肿瘤.以上结果说明ADSCs-Oct4细胞遗传性状稳定,无致瘤性,为深入开展ADSCs研究提供了实验依据.     

稀土镧对成纤维NIH3T3细胞生长的作用

研究了稀土镧对培养的成纤维NIH3T3细胞增殖,周期和凋亡的影响,并探讨了其相关机理。用MTT比色法检测了细胞的增殖,用流式细胞分析仪测定了细胞周期和凋亡。结果表明:LaCl3对NIH3T3细胞的凋亡没有明显的影响,但可明显促进成纤维NIH3T3细胞的增殖,且具有一定的时间和浓度依赖性。且随着LaCl3浓度的升高,处于G1期的细胞数量明显减少,而S期细胞数量显著增多,表明LaCl3可促进成纤维NIH3T3细胞G1/S期转换,加快细胞周期进程,从而提高成纤维NIH3T3细胞的增殖活性。此研究为进一步明确镧的生物学性质提供一定的实验依据。     

敲低EYA3基因抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长

为了探讨人眼缺失基因(EYA3)在人视网膜母细胞瘤发生发展中的生物学作用,构建了EYA3小干扰RNA (siRNA)的真核表达载体,并验证敲低效果和观察其对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞生长的影响.根据人EYA3的cDNA序列,将设计含有小发卡结构的寡核苷酸序列克隆到siRNA表达载体上;将重组质粒转染HEK293T细胞中,通过实时定量RT-PCR及Western印迹检测EYA3基因的表达水平;重组质粒稳定转染人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞并利用生长曲线检测EYA3对其生长的影响.结果表明:构建的siRNA能够抑制EYA3基因的表达,生长曲线验证EYA3 siRNA基因能抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长.最后结论是EYA3 siRNA能够抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长,本实验为进一步研究EYA3在视网膜母细胞瘤中的功能奠定了基础.     

GRP78异常O-糖基化对乳腺癌细胞侵袭迁移的影响

为了探索O-糖基化异常对GRP78促进人乳腺癌MCF-7细胞侵袭转移能力的影响,克隆人GRP78基因,利用点突变技术,构建了GRP78野生型及T648A、T648G2个糖基化位点突变真核表达载体.Western blot检测外源性GRP78在MCF-7细胞中的表达.利用划痕修复实验和transwell侵袭小室实验,研究GRP78第648位Thr突变后引起的异常糖基化对其生物学功能的影响.划痕实验结果显示与野生型相比,转染突变体的MCF-7细胞的覆盖面积较少.Transwell检测结果显示突变体转染组的侵袭细胞数少于对照组,说明GRP78 O-糖基化缺失后明显降低了其促进MCF-7细胞侵袭迁移的能力.本研究为深入探讨O-糖基化在介导GRP78生物学功能中的作用机制奠定了基础.     

人类T型钙通道α1G和α1H亚单位基因在细胞增殖中的功能

已经发现T型钙通道的表达与细胞增殖关系密切,然而T型钙通道的表达是细胞增殖的原因还是结果有待进一步研究.利用过量表达人类T型钙通道α1G和α1H亚单位基因(CACNA1G和CACNA1H)的HEK-293细胞研究了这两种基因在细胞增殖中的直接作用.通过RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α1G和α1H亚单位基因的过量表达;从生长曲线分析得到了细胞群体倍增时间,HEKα1G 细胞为(13.7±0.3)h,HEKα1H 细胞为(14.0±0.4)h,都短于对照HEK-293细胞的(22.1±1.1)h.流式细胞分析结果表明,在稳定转染细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高,相反地处于G1期的百分率比对照HEK-293细胞低.结果表明,T型钙通道α1G和α1H亚单位基因的过量表达都能显著促进细胞增殖,这一作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制.Western杂交结果提示了T型钙通道的过量表达是通过提高与细胞周期有关的蛋白质(CDK2,cyclin A和cyclin E)的表达水平刺激了细胞周期的进程从而促进细胞增殖.     

Stat3调控MMP9和TIMP1的转录与表达

通过脂质体瞬时转染Stat3重组质粒的方法在NIH3T3细胞中过表达Stat3;采用RT-PCR,Western blot以及荧光素酶活性分析的方法评估Stat3对MMP9及对其内源性抑制因子TIMP1的影响.结果表明:Stat3可增强MMP9及TIMP1基因启动子的活性,促进两者的转录与表达;并且Stat3对TIMP1的促进作用明显强于对MMP9的促进作用,从而使ECM的降解能力减弱,细胞外基质成分积累,导致纤维化的发生.