小鼠胎肺Ⅲ型上皮细胞的分离纯化及原代培养

用免疫黏附和差速离心法分离和纯化小鼠胎肺Ⅱ型细胞,所得细胞纯度达(90±2)%,产量为每5只小鼠胎肺收获(23.6±7)×106个细胞.原代培养的小鼠胎肺Ⅱ型细胞在12～24 h 开始贴壁,在36～48 h呈指数生长,72 h后生长减缓,4～5 d左右细胞开始变形分化.免疫荧光鉴定胎肺Ⅱ型细胞表面活性蛋白C(SP-C)染色阳性,透射电镜观察到细胞内板层小体,细胞中proSP-C蛋白在培养48 h后表达较高.体外病毒转染成功,可见强烈荧光表达.成功建立了小鼠胎肺Ⅱ型上皮细胞的培养模型.     

成骨细胞诱导骨髓基质细胞体外成骨的初步研究

目的:探讨在不使用细胞因子或化学药物的情况下,成骨细胞(Osteoblast,OB)与骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)混合培养时,成骨细胞提供的成骨微环境能否在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,并复合支架形成成熟的骨组织.研究成骨细胞诱导BMSCs有效成骨的最小比值(指成骨细胞与骨髓基质干细胞数量的比值).方法:SY别培养SD乳鼠的成骨细胞与SD大鼠的BMSCs,将成骨细胞和BMSCs以1:9、2:8、3:7、1:0的不同比例进行混合培养,通过测定第3、6、9天培养液上清中的碱性磷酸酶(ALP)的含量,研究成骨细胞促BMSCs有效成骨的最小比值.将两种细胞以该最小浓度比混匀接种于涂附Ⅰ型胶原壳聚糖材料支架上(直径9 mm,高3mm)作为混合培养组,相同终浓度的单纯成骨细胞和单纯BMSCs分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照.另设置低比值成骨细胞对照组(仅含有共培养组中相同的成骨细胞数,但不含有共培养组中的BMSCs).全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生骨进行评价.结果:成骨细胞和BMSCs以3:7的比例进行混合培养时已可实现有效成骨.3:7比例的混合培养组及阳性对照组(成骨细胞组)体外培养8周后大体观察和苏木素-伊红染色(HE)、ALP染色基本相同,均表达骨特异性细胞外基质Ⅰ型胶原,形成了较成熟的骨组织.阴性对照组(单纯BMSCs组)和低比值成骨细胞组,原细胞支架复合物变小、变形.低比值成骨细胞组在局部形成了少量的骨组织,阴性对照组(单纯BMSCs组)未能发现骨样组织形成.结论:在不使用细胞因子或化学药物的情况下,成骨细胞提供的成骨微环境能够在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化并形成成熟的骨组织.混合细胞中成骨细胞与BMSCs的比例为3:7时是有效成骨的最小比值.     

苯并(a)芘对体外培养人淋巴细胞免疫活性和HSP70的影响

不同浓度苯并(a)芘[B(a)P](0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)处理体外培养的人淋巴细胞系721.221,研究B(a)P对体外培养的人淋巴细胞免疫活性和热休克蛋白70的影响.染毒16 h,分别应用MTT比色法、Elisa法和Western blot法研究B(a)P对体外培养的淋巴细胞细胞活力、细胞因子IFN-α、interleukin-1α和interleukin-6分泌和热休克蛋白70表达情况的影响.与对照组比较,0.125～1.000μmol/L低剂量B(a)P染毒组促进细胞的生长(P＜0.05),1.000 μmol/L B(a)P染毒组细胞的增殖活性达到峰值,与溶剂对照组相比,增加了55％.2.000～ 16.000 μmol/L B(a)P染毒细胞,16 h后对细胞活力存在显著抑制作用(P＜0.05).IFN-α随着B(a)P染毒浓度的升高,IFN α分泌呈先上升后下降的趋势,1 μmol/L B(a)P染毒组分泌达到峰值,随后降低.IL-1α和IL-6分泌随着染毒浓度的增加而降低,与对照组相比有统计学意义(P＜0.05),呈现剂量-效应关系.HSP70随着染毒浓度的增加,呈现先增加后降低的趋势.本研究证实B(a)P对721.221细胞活力、免疫活性和应急因子的影响存在显著的剂量依赖性,为今后评估人群接触B(a)P对免疫系统和自身应急系统的毒性提供实验依据.     

鸽胚的细胞培养

用199培养液(含10％小牛血清)和0.25％胰蛋白酶,以鸽胚为材料进行组织培养,获得贴壁的细胞,并观察到细胞开始生长,72H后长成单层。     

ERK通路对TGF-β1介导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用

为研究不同浓度TGF-β1、不同作用时间对体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响,并在此基础上探讨ERK信号转导通路在TGF-β1介导的大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用.取大鼠胸主动脉,用贴块法进行原代培养,取3～5代细胞.分别施加不同浓度TGF-β1(0、0.01、0.1、1、10ng/mL)作用24h和10ng/mL TGF-β1作用不同的时间(0、8、12、16、20、24h),用MTT法测定各组细胞吸光值,确定TGF-β1作用浓度和时间.再取生长正常的细胞,分四组:对照组,TGF-β1组,ERK阻断剂组和 TGF-β1 ERK阻断剂组.继续培养24h后,用MTT法测细胞的增殖活性.TGF-β1浓度≥1 ng/mL作用24h时吸光值明显低于对照组(P＜0.05),10ng/mL TGF-β1作用时间≥12h时吸光值明显低于对照组(P＜0.05),10ng/mL TCF-β1作用时间≥12h时吸光值明显低于对照组(P＜0.05);与对照组相比,其他三组吸光值均明显降低(P＜0.05),ERK阻断剂组吸光值低于TGF-β1组(P＜0.0 5).TGF-β1呈浓度依赖和时间依赖方式抑制体外培养的血管平滑肌细胞的增殖,ERK信号转导通路可能不参与TGF-β1介导的大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用.     

血管内皮细胞分化实验模型的建立

取X期的鸡胚盘细胞进行体外培养,细胞于24h后开始贴壁生长,72h后,开始向上皮类细胞分化．用不同浓度的成纤维细胞生长因子（FGF）处理刚分离的胚盘细胞,结合间接免疫荧光法检测细胞第Ⅷ凝血因子相关抗原的表达,初步发现大于100μg/L的FGF能诱导胚盘细胞向内皮细胞分化．     

黄河兰州段水体中有机污染物对MCF-7细胞凋亡的影响及其机制

采用固相萃取法提取黄河兰州段中山桥(污染断面)、什川桥(自净断面)和新城桥(清洁断面)三个断面水样中有机污染物,用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测不同断面有机污染物对MCF-7细胞染毒后的周期分布、细胞凋亡率和细胞内游离[Ca2+]i的浓度,探讨水体中有机污染物的细胞毒性作用机制及其与细胞凋亡的关系.结果表明:染毒48 h,各断面MCF-7细胞的凋亡率由高到低依次为中山桥组(31.40±3.00)％、新城桥组(17.63±0.47)％、什川桥组(13.37±1.43)％,均显著高于对照组(8.1±0.25)％(P＜0.01);各组细胞主峰均在G0/G1期积聚(≥55％),说明有机污染物主要作用于细胞的G0/G1期,使细胞停滞于此期.各断面各剂量组有机污染物分别作用于MCF-7细胞24,48,72 h后,在不同时点细胞内[Ca2+]i浓度均升高,均显著高于对照组(P＜0.01);各组细胞内[Ca2+]i浓度随染毒时间的延长呈下降趋势,具有时间效应关系;在不同时点上无钙离子组和含钙离子组间均有显著性差异(P＜0.05),提示钙离子浓度增加与外钙无关.研究表明,黄河兰州段水体中有机污染物可影响体外MCF-7细胞的周期分布并诱导细胞凋亡,其作用机制还需进一步探讨.     

骨髓间充质干细胞移植治疗四氯化碳大鼠肝纤维化的实验研究

目的通过移植大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)治疗肝纤维化大鼠,并评价其疗效。方法通过全骨髓贴壁法分离培养纯化大鼠BMSC,用流式细胞仪对第3代BMSC进行表面抗原鉴定。选取清洁雄性SD大鼠20只,利用四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl_4)皮下注射构建大鼠肝纤维化模型,将肝纤维化大鼠随机分为BMSC组、PBS组,每组10只;分别通过尾静脉注射,予1 mL细胞浓度为1×10~6个/mL的BMSC细胞悬液、1mL PBS溶液,另取6只健康雄性SD大鼠作为空白对照组;移植后第5周处死各组大鼠,采集血液检测大鼠肝功;取肝脏组织切片进行HE、Masson染色,观测大鼠肝细胞组织损伤及纤维化程度,利用Image J软件计算肝脏胶原容积分数(Collagen Volume Fraction,CVF);通过qRT-PCR检测各组大鼠肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达。结果(1)通过流式细胞术鉴定BMSC表面抗原,CD29、CD90高表达,CD45低表达。(2)与PBS组比较,BMSC组大鼠肝脏肝小叶网状结构较完整,CVF降低且Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达减少(P0. 05)。(3)与PBS组相比,BMSC组大鼠肝功能改善,且差异具有统计学学意义(P0. 05)。结论同种异体移植BMSC可以有效减少肝脏胶原沉积,改善肝纤维化大鼠肝脏功能。     

盐酸甜菜碱对淡水白鲳生长性能、鱼体解剖特性和肉质的影响

以淡水白鲳为试验对象,研究了盐酸甜菜碱对生长性能,鱼体解剖特性和肉质等的影响.198尾淡水白鲳鱼种(平均初体重为83.14±15.36 g)按养殖试验要求分成六组(每组三个重复,每个重复11尾).六组试验鱼分别饲以含0、0.1 %、0.2 %、0.4 %、0.6 %和0.8 %盐酸甜菜碱的相同饵料(含粗蛋白41.03 %).试验鱼在循环滤水、充氧、控温条件下养殖,试验期为60天.结束时,按要求从每个重复中挑选体重相近的鱼9尾,共162尾,按常规方法测量体长、称重、解剖、采血和采取有关样品;每组取6尾,共36尾鱼进行整鱼常量养分和微量元素含量的测定. 养殖试验结果表明添加不同剂量的盐酸甜菜碱均促进了淡水白鲳的生长,提高了饲料利用率,其中以0.2%添加量组效果最为显著,平均尾增重和日增重分别提高了21.89 %(P＜0.01)和22.11 %(P＜0.01),其次为0.1 %添加量组,分别提高了8.36 %(P＜0.05)和8.42 %(P＜0.05). 添加盐酸甜菜碱使饵料系数显著下降,0.2 %、0.1 %、0.4 %和0.6 %添加量组分别下降了24.22 %(P＜0.01)、13.99 %(P＜0.01)、9.92 %(P＜0.01)和8.20 %(P＜0.01),但对摄食量无明显影响(P＞0.05). 解剖试验结果显示添加盐酸甜菜碱可明显改善鱼体解剖特性.0.1 %、0.2 %组肥满度上升(P＞0.05),去内脏比显著增加,其中0.2 %、0.4 %和0.8 %组分别提高了1.63 %(P＜0.01)、1.98 %(P＜0.01)和3.15 %(P＜0.01);内脏比呈下降趋势,其中0.8 %组降低13.20 %(P＜0.01);肝重比0.1 %、0.2 %、0.4 %和0.8 %组分别降低了17.03 %(P＜0.01)、12.61 %(P＜0.03)、16.02 %(P＜0.01)和21.27 %(P＜0.01);肠脂比0.6 %和0.8 %组分别降低了18.04 %(P＜0.01)和44.94 %(P＜0.01),胃重比和肠重比,0.1 %、0.2 %、0.4 %添加量组呈升高趋势,其中0.2 %组分别增加了12.57 %(P＜0.03)和20.51 %(P＜0.01),但0.6 %和0.8 %添加量呈组下降趋势.添加盐酸甜菜碱使整鱼水分和粗脂肪含量呈下降趋势(P＞0.05),粗蛋白、粗灰分和磷含量呈上升趋势,其中0.6 %添加量组分别提高了21.08 %(P＜0.05)、23.20 %(P＜0.05)和20.55 %(P＜0.05).盐酸甜菜碱可使整鱼微量元素积累增加,其中0.4 %添加量组Na含量提高了15.63 %(P＜0.01),0.1 %、0.4 %、0.6 %和0.8 %组Mg含量分别提高了14.29 %(P＜0.05)、14.29 %(P＜0.05)、28.50 %(P＜0.01)和21.43 %(P＜0.01). 本试验结果提示甜菜碱可促进生长,改善饲料利用率,提高鱼可食率,改善肉质.     

胚胎大鼠肺成纤维细胞的体外培养

目的:探讨胚胎大鼠肺成纤维细胞的体外培养条件.方法:采用胶原酶消化19d胎鼠肺组织块,经差速离心和反复贴壁法,分离、纯化肺成纤维细胞后采用加胎牛血清的DMEM培养液,进行细胞培养.用波形蛋白免疫细胞化学染色对所分离的细胞进行鉴定.结果:细胞培养24h后有一定量细胞贴壁,48h后贴壁细胞开始生长.结论:该实验方法可以成功地培养大鼠胚胎肺成纤维细胞.     

银杏叶提取物对大鼠真皮FB增殖及胶原蛋白分泌的影响

原代培养大鼠真皮成纤维细胞（Fibroblast,FB）传代培养后,以不同浓度的银杏叶提取物（EGb761,20、50、100mg／L）对其生长进行干预,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测药物干预后24、48、72h时FB细胞活力变化,碱水解法测定药物干预后3、6d时培养液中羟脯氨酸含量变化,以分别反映EGb761对大鼠真皮FB增殖及胶原蛋白分泌的影响。研究表明EGB761在一定范围内能促进大鼠真皮FB增殖及及胶原蛋白分泌,且呈一定的剂量、时间相关性。     

大豆苷元对体外培养大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的探讨大豆苷元对体外培养大鼠成骨细胞的增殖与分化能力的影响.方法从新生大鼠颅骨中分离培养大鼠成骨细胞,加入不同浓度的大豆苷元溶液进行培养,48,72 h后用MTT法测定成骨细胞的增殖,PNPP法测定碱性磷酸酶活性及RIA法测定骨钙素含量.结果不同浓度的大豆苷元作用48,72 h后,测定OD值均高于阴性对照组;成骨细胞在大豆苷元的作用下,与阴性对照相比,碱性磷酸酶活性显著增高;成骨细胞BGP含量显著增加.结论大豆苷元具有促进体外大鼠成骨细胞的增殖以及分化的作用.     

合欢花水提物对大鼠脑胶质瘤C6细胞株的增殖抑制与凋亡诱导作用

采用MTT法检测合欢花水提物对C6细胞增殖活力的影响,流式细胞术检测该水提物对C6细胞的诱导凋亡作用.结果表明:合欢花水提物能抑制C6细胞的增殖,且具有剂量和时间依赖性,其在24 h、48 h、72 h时对C6细胞的半数抑制率(LD50)分别为:305 μg/mL、50 μg/mL、15 μg/mL.流式细胞术结果显示:200 tμg/mL、300μg/mL合欢花水提物均可诱导C6细胞发生早期凋亡,与对照组细胞相比,早期凋亡率分别由对照组的0.7％增加到了4.3％、14.3％.提示合欢花水提物抑制C6细胞增殖机理与诱导细胞凋亡途径有关.     

磷酸钙法将MMP-2，MMP-3双基因干扰载体转入HEK293T细胞的效率观察

检测用磷酸钙法能否将修饰后用于沉默MMP-2,MMP-3基因的慢病毒载体有效地转入到HEK293T细胞。利用磷酸钙法,MMP-2,MMP-3双基因干扰载体（MMP组）与对照质粒（对照组）被分别转染HEK293T细胞,在转染后的第24,48及72h,通过计算绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞数的百分比来判断转染效率。转染24h后,两组细胞均生长状况良好,荧光显微镜下观察,已有大量绿色荧光出现,计算MMP组转染效率为（91．5±6．2）％,对照组转染效率为（80．3±4．7）％;转染后48—72h,两组感染效率均未见明显下降。与对照相比,插入了MMP-2,MMP-3 shRNA模板序列的慢病毒载体没有降低磷酸钙法转染HEK293T细胞效率,反而有所增高。     

一次力竭性离心运动对大鼠血清肌酸激酶(CK)活性的影响

通过建立大鼠下坡跑运动损伤模型,研究一次力竭性离心运动后不同时刻大鼠血清CK从亚细胞水平探讨一次力竭性离心运动后,骨骼肌超微结构损伤发生的机制,为运动训练和大众健身提供理论依据.将雄性SD大鼠48只随机分为6组(每组8只):安静对照组(C),运动后24h组(E2),运动后即刻组(E0),运动后48h组(E3),运动后12 h组(E1),运动后72 h组(E4),以速度16 m/min,坡度-16°进行跑台运动,运动100 min后,休息5 min,然后再运动100 min.在不同时刻观察大鼠血清CK活性的变化,结果表明:运动后即刻血清CK活性(2 035.42±426.49 U/L)与对照组血清CK活性(293.66±76.07 U/L)相比,非常显著的增高(P0.01),达到了峰值,而后逐渐恢复,运动后72 h组血清CK活性(425.51±143.34 U/L)与即刻组血清CK活性相比已显著恢复(P0.01),与对照组相比没有统计学意义(P0.05),但没有完全恢复到安静时水平.一次力竭性离心运动后即刻大鼠血清CK活性显著增高,而后逐渐恢复,运动后72h接近正常,血清CK活性的变化能够反映运动后骨骼肌超微结构损伤的状况.     

鱼藤素对大鼠H9C2心肌细胞的生存活力和凋亡的影响

为探讨不同浓度的鱼藤素(Deguelin)对大鼠H9C2心肌细胞活力及凋亡的影响。通过将不同浓度(0、10、50、100、500、1 000 nmol / L)的鱼藤素作用于H9C2细胞24 h、48 h、72 h,应用CCK-8 法测定鱼藤素对H9C2细胞存活率的影响;划痕实验检测(0、10、50、100、500、1 000 nmol / L)浓度的鱼藤素作用于H9C2细胞24 h、48 h后,对细胞迁移能力的影响。应用Hoechst 33342 / PI 双染试剂盒检测不同浓度鱼藤素(0、10、50 nmol / L)作用于H9C2细24 h后对细胞凋亡的影响。结果表明：10、50、100、500、1 000 nmol / L的鱼藤素作用H9C2细胞24 h、48 h、72 h后,能明显抑制其存活率,10、50、100、500、1 000 nmol / L的鱼藤素作用H9C2细胞24 h、48 h后,能明显抑制其迁移能力,且呈浓度和时间依赖性;荧光倒置显微镜观察发现鱼藤素在低浓度时便可以诱导H9C2细胞凋亡。可见鱼藤素能够呈时间和浓度依赖性来抑制H9C2细胞的生存活力并诱导其凋亡。     

NDV-Lasota毒株在鸡胚成纤维细胞上的增殖特性

为探讨NDV-Lasota株在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的增殖特性,采用细胞病变观察、空斑技术、红细胞吸附试验和血凝试验等方法对Lasota株在CEF上的感染特性及其增殖动力学进行检测。结果表明:NDV-Lasota株在添加外源性胰蛋白酶的条件下,可在CEF上有效复制,细胞维持液中胰蛋白酶浓度为25μg/mL时,病毒感染细胞24 h后,红细胞吸附试验呈阳性;30 h后培养上清液血凝效价大于22;48 h后出现明显的细胞病变;72 h后细胞单层上形成边界清晰、圆形的小空斑。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进

探讨更为简单的SD大鼠心肌细胞原代培养的方法,使分离的心肌细胞达到理想的存活率和纯度,为临床应用建立心肌细胞模型.取出生24 h内SD大鼠的左心室,剪碎、消化、分离和纯化,进行培养,0.1 g/L胰酶消化,可以分离到形态完整、贴壁生长的心肌细胞.进一步通过离心、差速贴壁和化学试剂抑制非心肌细胞生长,纯化得到95%以上的心肌细胞.成功建立了心肌细胞体外培养模型,获得了高纯度的心肌细胞.