应用核型多角体病毒载体在家蚕和家蚕培养细胞中高…

将人尿激原ｃＤＮＡ分别插入家蚕核型多角体病毒转移载体ｐＢＫ２８３和ｐＢＦ４中，构建成两个重组质粒。所构建的这两个重组质粒与野生型家蚕核型多角体病毒ＤＮＡ共转染家蚕培养细胞，经病毒斑实验筛选出含ｐｒｏ－ＵＫ ｃＤＮＡ的稳定重组病毒株ＢｍＮＰＶ－ｐｋ１和ＢｍＮＰＶ－ｐｋ２。将此两株蛋白平板溶圈测活法和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析细胞培养上清及细胞和家蚕的体液及组织，证实均有ｐｒｏ－ＵＫ表达。家蚕培养细胞的     

家蚕生物反应器与家蚕实验动物化饲育技术

以家蚕为生物反应器 (重组家蚕核型多角体病毒表达系统 )生产基因工程产品 ,具有成本低、安全、产品产量与活性高的优点。随着近年生命科学和生物技术的迅猛发展 ,需要发展新的实验动物品种、特别是利用低等动物代替哺乳动物 ,大力开发动物资源型功能 ,造福人类。本文报道我所利用家蚕表达外源基因与家蚕实验动物化饲育技术方面一些研究成果。由家蚕细胞、转移载体、修饰的BmNPV、家蚕幼虫或蛹组成家蚕表达系统。获得了含有日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的重组病毒 (rsj14NPV)和含有日本血吸虫 2 8KDGST基因的重组病毒 (rsj2 8NPV)。r…     

人生长激素基因在昆虫细胞中表达的初步研究

将人生长激素hGH的cDNA片段克隆在转移载体pVL1393的多角体蛋白基因启动子下游,构成重组转移载体pVL1393hGH,将该质粒DNA与昆虫杆状病毒（AcNPV）DNA共转染秋粘虫（Spodopterafrugiperda）细胞Sf9,通过体内同源重组,hGH基因取代多角体蛋白基因,从而整合到病毒基因组上,经感染昆虫细胞后表达外源hGH基因,通过反复病毒空斑纯化,获不含多角体的重组病毒,利用免疫化学发光法测定hGH表达量达40μg／mL．     

家蚕病原的超微结构及其致病机制

五、中肠多角体病毒在五十年代仅见到8种昆虫的中肠细胞中有本病毒的侵入,现在已发现100种以上的鳞翅目昆虫受到中肠多角体病毒(CPV)的侵染,此外,在少数脉翅目和双翅目昆虫中也发生本病,它们之间是否完全不同、对家蚕能否感染尚不了解。病毒在侵染细胞内形成多角体,是这类病毒的特征,对家蚕来说有在中肠细胞质内形成多角体的,叫做质型病毒,其在核内形成多角体的,叫做核型病毒,后者尚属新的发现。     

形成多角体家蚕重组病毒通用转移载体构建

从家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）通用转称载体ｐＢＫ２８３和粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）转移载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列出发，构建了一个７．２ｋｂ能形成多角体且可以用于克隆含不同读码框外源基因的ＢｍＮＰＶ通用转移载体系列ｐＢＭＸ３．ｐＢＭＸ３系列以ＢｍＮＰＶ多角体结构基因上游的１．９ｋｂ和下游１．３ｋｂ的片段作为与ＢｍＮＰＶ基因组进行体内同源重组的同源序列；ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列的ＳＸＩＶ双启动子用于外源基因的表达；ＡｃＮＰＶ的多角体基因作为重组病毒形成多角体的基因．以ＢｍＮＰＶ－ＬａｃＺ（ｏｃｃ－ｇａｌ＋）为出发株病毒，ｐＢＭＸ３系列的重组病毒筛选有ｏｃｃ＋和ｇａｌ－两个遗传标记     

人工饲料育家蚕/杆状病毒表达猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因

以重组病毒Bm-BacPAK6-E2接种全龄人工饲料育及5龄桑叶育家蚕皓月×菁松幼虫、蛹,观察重组病毒的感染发病情况,调查病蚕、蛹的采血量并进行SDS-PAGE分析.结果表明,全龄人工饲料育家蚕接种重组病毒的成功率、采血量等指标均与5龄桑叶育相近,SDS-PAGE蛋白质电泳在家蚕幼虫、蛹血淋巴中均检测到1条与目的蛋白理论分子量(63 kD)相符的特异性蛋白条带,初步认为是重组病毒Bm-BacPAK6-E2的融合表达产物.     

二连体人干细胞因子基因的构建及其在昆虫细胞中的表达

应用DNA重组技术构建两端为人干细胞因子 (hSCF) 1～ 16 5肽编码区 ,中间为柔性连接肽 (GGGGSGGGGSGG)编码区的头尾相连的二连体基因 (dSCF) ,并将其插入杆状病毒转移载体 pVL1392中 .重组转移载体 pVL1392 dSCF与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒AcNPVDNA共转染草地贪夜蛾细胞Sf9,经胞内同源重组和 4轮筛选获得纯净的重组病毒AcNPV dSCF .重组病毒感染Sf9单层培养细胞时 ,主要以分泌形式表达二连体蛋白 ,经MTT比色法测得dSCF的表达量约为 1180units/3× 10 6cells .WesternBlotting鉴定了昆虫细胞表达的重组人二连体干细胞因子 (rhdSCF) ,两种主要产物的分子量分别为 4 0kDa、4 9kDa .     

DNA甲基转移酶抑制剂DAC对AcMNPV感染的影响

通过DNA甲基转移酶抑制剂DAC(地西他滨,decitabine)改变DNA甲基化水平,研究杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)DNA的甲基化与病毒复制和基因表达调控的关系。通过流式细胞术和病毒mRNA的Real-time PCR检测发现,低浓度DAC(30nmol/L)处理细胞后会使报告基因绿色荧光蛋白基因(Green fluorescent protein gene,gfp)的表达提前,且表达水平明显上升。对低浓度DAC处理组和对照组产生的病毒效价监控表明,低浓度DAC的存在可以提高病毒的效价。经连续DAC处理,在第六代细胞中生产的AcMNPV多角体感染甜菜夜蛾后,幼虫死亡率明显高于对照组。这些结果表明,DAC对杆状病毒DNA复制和基因表达具有一定作用。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

盗毒蛾核型多角体病毒的分离鉴定

作者从自然罹病死亡的盗毒蛾幼虫中分离到一株昆虫病原物,经鉴定,该病原物为盗毒蛾核型多角体病毒(PsNPV),该病毒包涵体多数呈三角形、四边形,部分呈多角形,其大小为1000～2000nm;病毒粒子呈杆状,为单粒包埋型(SEV),其大小为(250～350)nm×(40～60)nm.通过感染试验测定了盗毒蛾核型多角体病毒的毒力,结果显示其LC50为3.34×104PIB/mL;以3×106PIB/mL和3×105PIB/mL两种浓度感染盗毒蛾幼虫,测得LT50分别为5.78d和6.24d.     

白僵蚕中甾体类化学成分的研究

对白僵蚕的化学成分进行分离鉴定。采用溶剂提取、萃取、反复硅胶柱色谱、ODS、制备液相色谱法等方法进行分离纯化,根据化合物的理化性质和光谱数据鉴定其结构。结果从白僵蚕分离得到4个甾体类化合物,分别为5α,6α-环氧-（22E,24R）-麦角甾-8（14）,22-二烯一30,7α-二醇（1）、7α-甲氧基-（22E,24R）-5α,6α-环氧麦角甾-8（14）,22-二烯-3β醇（2）、（22E,24R）-麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇（3）、豆甾醇-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇（4）,4个化合物均为首次从白僵蚕中分离得到。     

Subunit Structure and Conformation of Bombyx Mori Silk Proteins

Molecular weights of the silk fibroin were determined by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of so-didium dodecyl sulfate (SDS - PAGE): The silk fibroin molecule consisted of subunits a, b and c with molecular weights of 280 kD, 230 kD and 25 kD respectively, of which the b subunit was composed of two subunits e and f with molecular weights of 130 kD and 125 kD, respec-tively, connected by disulfide bonds. The conformation of silk fibroin and subunits was determinated by Raman spectroscopy and Large angle X - ray diffraction) LAXS. The native silk fibroin only contained a - helix and random coil, but there were three conformation such as random - coil.a - helix and β - sheet in the silk fibroin dissolved in KSCN solution and frozen at - 20 °C. This suggested that KSCN solution and - 20°C freezing action could lead to the conformational transi-tion from random - coil and a - helix to P - sheet. The a subunit mainly existed in β - sheet conformation, in con-trast, the c subunit was chie     

Examination of Subunit Composition of Bombyx Mori Silk Fibroin

Main subunits of the silk fibroin were separated by GFC(gel filtration chromatography)technigue.The nativesilk fibroin and α,c subunits were measured by gel elec-trophoresis.The aminoacid compositions of the nativesilk fibroin and α,c subunits were analyzed by means ofaminoacid measurement.Some properties of silk was inter-preted in view of subunit composition of silk fibroin.     

野桑蚕Ras 2基因的cDNA分子克隆及其特征

基于家蚕(Bombyx mori)Ras2基因的cDNA序列设计引物,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆了野桑蚕(Bombyx mandarina)Ras2基因,得到的cDNA序列长631bp,含有一个603bp的完整开放阅读框,由2个外显子和1个内含子组成,编码一个由200个氨基酸残基组成的蛋白质.该蛋白质的等电点为6.33,分子量为22.866kD.其氨基酸序列与其他昆虫Ras2氨基酸序列的同源性较高,且具有它们Ras2基因的典型特征.组织表达谱表明,该基因mRNA在野桑蚕的表皮、马氏管、中肠、脂肪体、丝腺中均有不同程度的表达.     

桑野蚕雄蛾的性信息素感受细胞

本文用单细胞记录方法发现反－１０，顺－１２－十六碳二烯醇和反－１０，顺－１２－十六碳二烯酸均能引发桑野蚕雄蛾触角中毛形感器的电反应，前者发放振幅较大的神经脉冲，后者发放小脉冲，选择性适应试验表明，毛形感器中存在对上述两个组分敏感的不同类型的嗅觉感受细胞。     

Study on Bombyx mori silk treated by oxygen plasma

Study of the morphology, aggregation structure and properties of Bombyx mori silk treated by low temperature oxygen plasma showed that slight flutes appeared on the surface of Bombyx mori silk fiber and that its surface structure changed after plasma treatment. The conformation also changed and crystalline degree decreased. The stannic filling rate of treated fiber was improved. Because of etching, the weight of the fiber decreased but the breaking strength changed little after short-time treatment.     

家蚕新的非编码RNA功能初探

构建了家蚕50～500 nt非编码RNA的cDNA文库,发现了189个新的ncRNA,其中一个小RNA-Bm-86在家蚕幼虫和蛹中的表达量显著高于卵和成虫.利用生物信息学软件对该ncRNA的特性及其与上下游基因的关系进行了深入分析,并利用Northern杂交和半定量RT-PCR技术对该ncRNA与其宿主基因在家蚕不同组织的表达情况进行了研究.结果发现,该ncRNA属于H/ACA box snoRNA家族,是由家蚕eIF5A基因的第二个内含子转录产生的,且在家蚕中没有明显的靶标位点.分析其上下游基因结构发现,在其上游263 bp处存在着一个可能的启动子位点,表明其有独立转录的倾向.进一步分析Bm-86与其宿主基因eIF5A在家蚕不同组织部位的表达情况发现,二者在表达上存在着负相关的关系,且该现象在丝腺中尤其明显.推测Bm-86可能通过影响eIF5A基因的表达参与到家蚕丝腺发育调控过程中.     

一个家蚕基因组MAR的克隆及其初步分析

家蚕（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）基因组大片段ＤＮＡ经ＢａｍＨＩ完全酶解后,克隆到质粒ｐＵＣ１８中而构建成一个家蚕基因组文库．通过与家蚕细胞核基质的体外结合,从该文库中筛选到一个包含ＭＡＲ的克隆ｐＣ１１ｅ,其中外源插入片段Ｃ１１ｅ长约２．３ｋｂ．Ｃ１１ｅ的限制性酶谱分析及其酶切片段的体外结合实验表明,ＭＡＲ位于Ｃ１１ｅ上的ＳｐｈＩ和ＨｉｎｃⅡ位点之间,长１．０ｋｂ．由于这是家蚕中发现的第一个ＭＡＲ,因此我们称之为ＢｍＭＡＲ１．进一步借助ＤＮａｓｅＩ敏感性分析和ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ,对ＢｍＭＡＲ１在家蚕细胞内与核基质结合的情况以及它与人β干扰素（ｈｕＩＦＮ－β）基因５′上游ＭＡＲ之间的同源性进行了研究．     

家蚕卵蛋白的 SDS-PAGE 分析(动物科学)

本研究探讨了蛋白质提取方法、十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件对家蚕卵蛋白分离效果的影响。分别用裂解液提取法、TCA沉淀法、冷丙酮沉淀法和TCA-丙酮沉淀法制备蛋白质样品,然后进行6%～12%、6%～15%两种梯度胶的SDS-PAGE,获得了不同提取方法和电泳条件下的电泳图谱用以比较家蚕卵蛋白分离效果。结果表明用TCA-丙酮沉淀法除盐,再用含9 mol.L-1尿素、4%CHAPS、1%DTT的裂解液重悬,最适合家蚕卵蛋白提取;6%～12%梯度胶对家蚕卵蛋白的分离较为适宜。利用这一优化方法对家蚕感染微孢子虫的蚕卵和正常蚕卵进行了比较研究,在分子量66 kD和85 kD处找到了与感染微孢子虫相关的蛋白,为进一步进行正常蚕卵和感染微孢子虫蚕卵的蛋白质组学研究奠定了基础。