禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶基因（neuramidinase,NA）序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA（49～1 587 bp）、pMET A/NA（121～1 200 bp）,电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了依据。     

非结构蛋白NS1-ELISA检测禽流感野毒感染抗体

利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol／I的IPTG诱导表达5 h,经15％的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的 NS1融合蛋白,且以包涵体的形式存在,NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化或用尿素变性复性,获得纯度较高的NS1蛋白,并以此为抗原,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法。最佳包被浓度为2．5μg／ml,血清的最佳稀释倍数为1:200, 酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5 000。重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应。分别检测H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗和H9N2纯化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分别为0．225、0．210、0．205和0．184．均为阴性;而对H9N2和H5N2亚型活毒感染10-15 d的血清进行检测,各5份,其平均OD490值分别为0．610和0．619,均为阳性。因此,NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,可作为一种鉴别诊断标记,但不能区分亚型．具有A型特异性。NS1-ELISA 方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与表达

 根据已知H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计、合成克隆引物.自灭活的云南地方H5N1亚型病毒阳性临床组织样品中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(Pyobest^TMDNA Polymerase)扩增HA基因,采用Invitrogen定向表达系统(Champion^TMpET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组HA,分子质量约78ku.采用阳性血清经免疫印迹及ELISA分析重组HA的免疫反应性,结果表明重组HA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性.     

禽流感病毒HSNl血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达毒

目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒HSNI血凝素基因(hemaggludnin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA) 序列,为制备抗体和基因T程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5NI全长HA、NA基因并测序的基础 上。将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A／HA(49一l 587 bp)、pMET A／NA (121—1 200 bp),电转化真核酵母菌pMADl6,甲醇诱导表达,利用Ni“亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用 Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS—PAGE显示蛋白表 达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95％以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原 性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5NI HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的 开发等进一步的研究提供了依据。     

病毒样颗粒为阳性对照的H5N1实时荧光定量PCR检测方法的建立

合适的标准品对实时荧光定量PCR(qPCR)检测高致病性H5N1禽流感病毒(avain influenza virus,AIV)十分重要.本研究将H5N1AIV HA基因的部分序列插入到能够表达MS2噬菌体病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)DNA序列的表达载体上,诱导表达后得到了包裹有H5N1AIV HA基因RNA片段的VLP.该VLP能够耐受核酶的消化,形态与MS2噬菌体病毒颗粒形态相同.利用表达的VLP作为阳性标准品及设计的特异性荧光探针、淬灭链,使用优化的qPCR反应体系,得到qPCR检测H5N1亚型AIV的阳性对照标准曲线.研究结果为高致病性H5N1亚型AIV的准确定量检测提供了基础.     

H5N1亚型禽流感病毒M基因的克隆与分子进化分析

以一株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增M基因全长,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,测序结果表明所克隆的982个核苷酸的片段包含了M1和M2基因的完整阅读框架,通过软件推导M1和M2基因分别编码252和97个氨基酸,将M全长序列与Genbank收录的10株H5N1亚型流感病毒M基因序列进行比较,病毒株之间M基因核苷酸序列同源性为92.3%～99.3%,编码的两个蛋白M1和M2氨基酸序列间同源性分别为为96.0%～98.8%和92.9%～99%,分子进化分析揭示了病毒株间的亲源关系.     

截短型HCV NS5B RNA聚合酶在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达NS5B蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化NS5B蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV NS5B RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的表达与纯化

根据GenBank报道的PRRSV VR2332基因序列设计引物,经RT - PCR扩增,得到大小约为390 bp的阳性产物;利用Bam H Ⅰ,EcoR Ⅰ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE,Western blot分析.结果表明:克隆的N蛋白基因与GenBank报道的VR2332基因同源性为93.83％;重组菌株经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;经筛选得到最佳诱导条件,即1 mmol/L IPTG诱导6h,蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635％,SDS-PAGE后切胶回收可得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础.     

流感病毒H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定流感病毒H3N2血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆流感病毒H3N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(52 bp～1 549 bp)、pMET A/NA(121 bp～1 260 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了流感病毒H3N2 HA、NA基因序列,为流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗开发等进一步研究奠定了基础。     

GST-Jab1融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

目的获取GST-Jab1蛋白,进一步研究Jab1的功能。方法以pMSCVneo-Jab1为模板,PCR扩增Jab1 DNA片断,EcoRI和XhoI双酶切后克隆至pGEX-5X-1表达载体,测序验证。将正确重组的pGEX-5X-1-Jab1表达质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导后,超声破碎细胞,用GST琼脂糖珠对上述表达产物进行纯化,SDS-PAGE、Western Blot分析和鉴定诱导表达和纯化的GST-Jab1蛋白质。结果成功构建了pGEX-5X-1-Jab1重组表达载体,SDS-PAGE分析结果显示表达和纯化的蛋白质与融合蛋白GST-Jab1预期分子量一致,Western Blot鉴定结果证实纯化的蛋白质为GST-Jab1。结论成功地表达、纯化了GST-Jab1融合蛋白。     

1-L-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖的热解研究

采用离线裂解装置分别在200℃，300℃，400℃三个不同温度点对-L-脯氨酸-I-脱氧-D-果糖（PF）进行裂解，用二氯甲烷收集产物，并采用GC／MS联用技术进行初步定性分析．结果表明：PF在不同温度下裂解产物不一样，高温裂解产物较多；裂解产物大部分为杂环类化合物（如吡咯、吡咯烷类、呋喃、吡喃、呋喃酮、吡喃酮等等），这些物质是卷烟烟气中重要的致香成分．     

加拿大奥委会组织治理的特征及启示

加拿大奥委会在提升国家队竞技表现、推选本国奥运申办城市、开展奥林匹 克文化教育活动等领域发挥了核心功能。 研究采用文献资料、逻辑分析等方法,归纳总 结加拿大奥委会组织治理的内容与特征,认为其具有清晰的组织使命愿景、民主的议事 决策架构、严格的组织行为监督、良好的财务运行系统和共赢的品牌营销模式。 中国奥 委会可以借鉴其治理经验,保持治理模式的本土化、实现治理目标的完整性、扩大治理 主体的代表性、 提 高 治 理 过 程 的 透 明 度, 不 断 增 强 组 织 治 理 能 力 并 实 现 组 织 治 理 现 代化。     

1,1,1,2—四氟乙烷的合成研究

１，１，１，２－四氟乙烷（ＣＦ３ＣＨ２Ｆ，ＨＦＣ－１３４ａ）作为氟氯烃（ＣＦＣｓ）无污替代物广泛应用于致冷，发泡及气溶胶等行业，该文叙述了ＨＦＣ－１３４ａ的合成路线，通过对四氯乙烯（ＰＣＥ）合成路线及三氯乙烯（ＴＣＥ）合成路线的比较，选择以ＴＣＥ为原料，经过中间体１，１，１－三氟－２－氯乙烷（ＨＣＦＣ－１３３ａ）两步气相氟化合成ＨＦＣ－１３４ａ的线路。     

拟南芥gpa1-1/Atnos1双重突变体的筛选鉴定

异三聚体G蛋白和NO都是植物体内作用广泛的细胞信号物质,将gpa1-1和Atnos1进行杂交,筛选鉴定拟南芥G蛋白α亚基与NO合酶基因双重缺失突变纯合体,可为研究相应基因及其功能提供直接模式材料,也为在分子水平上探索异三聚体G蛋白和NO的各种生理作用及其在信号转导中的相互关系提供模式材料.     

固-液相转移催化合成1-氰基环丁烷-1-羧酸乙酯

以PEG6 0 0为相转移催化剂 ,无水碳酸钾为碱 ,1 ,2 -二氯乙烷为溶剂 ;氰基乙酸乙酯和 1 ,3-二溴丙烷为反应原料 ,经缩合反应较高产率的合成 1 -氰基环丁烷- 1 -羧酸乙酯 ,收率达 6 4 % ,此方法反应条件温和 ,原料便宜易得 ,操作简便安全。     

基于MIKE11和MIKE21的城市暴雨洪涝灾害风险分析

应用MIKE 11和MIKE 21分别构建北京市大兴区天堂河下游地区一维和二维水动力学模型,采用DHI MIKE FLOOD耦合模拟了不同暴雨重现期下该地区的淹没特性.为分析该地区暴雨洪涝灾害的危险性,研究模拟了不同情景下各骨干渠道考虑限制下泄流量的排水状况,整个研究区淹没范围随时间的演变趋势和空间上的分布状况.研究结果表明,整个研究区现状防洪能力不足20a一遇设计标准,且研究区局部区域最大淹没深度超过2m,最大积水时间超过8h,是防洪排涝的重点区域.该结果可为下一步暴雨风险评估,滞洪区的选址和闸坝调度方案的制定提供参考依据.     

1 1维N=1超Poincaré张量运算

超引力张量运算目的是构造代数离壳封闭的各种超引力模型.文中建立了1 1维 N=1超Poincare张量运算并详细地导出了多重态的定域超对称变换性质及不变作用量密度公式.     

1＋1维动态时空Dirac粒子的热效应

对以普通的时间ｔ为变量的１＋１维动态时空中对Ｄｉｒａｃ旋量粒子的动力学行为进行了研究。采用既不同于稳态又不同于以超前爱丁顿坐标Ｖ描述的动态时空的乌龟坐标方程。得到了黑洞附近Ｄｉｒａｃ方程的解，求得了视界位置和Ｄｉｒａｃ粒子的辐射温度及谱，并且得到此黑洞的一个特殊性质，它的局部事件视界是由两个视界面组成的，它的温度是由两个事件视界共同决定的。     

正丁醇溴化制备1-溴丁烷实验的优化

在有机化学实验中,制备1-溴丁烷是一个具有代表性的卤代烃合成实验,但该反应过程中常常伴随消除反应和重排反应的发生,如果实验操作控制不当,容易造成副产物增多,产物收率低,甚至实验失败。从该反应的原理入手分析了影响1-溴丁烷制备实验效果的因素,改进了浓硫酸滴加的量和流程操控、产品的提纯等工艺条件,并取得了较好的实验效果。在最佳反应条件下,1-溴丁烷的产率可达80%,为优化实验教学方案提供了参考。     

面向认知的1:1数字课堂信息序列

每个学生持有智能设备的1:1数字课堂是教育信息领域的最新发展,需构建面向认知的数字系统模型,学习信息采集方法,实现学习成像。基于符号动力学思想设计人机耦合学习认知过程的数据采集方法即认知符号序列,应用于英语单词学习中,可获得A-Z字母混淆认知表及单词认知网络拓扑像。