过量表达苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌合成L–异亮氨酸的影响

考察过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L–异亮氨酸的影响.将解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶基因ilvA(F383V)连接大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19,过量表达于L–异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW.经5 L发酵罐分批补料发酵产酸实验,与出发菌株C.glutamicum YILW相比,耗糖高峰期滞后,L–异亮氨酸产量增加了10.3%,副产物L–蛋氨酸、L–赖氨酸含量分别降低了33.3%2、6.5%,发酵液中没有L–苏氨酸的累积,乳酸的累积量增加了41.7%.对发酵稳定期的代谢流分布研究表明,过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使HMP途径流量增加了31.7%,L–异亮氨酸生物合成途径的代谢流提高了8.5%.     

表达异源木糖异构酶对谷氨酸棒杆菌利用木糖的影响

微生物细胞木糖代谢对生物质水解液全利用和促进特定重要化学品的合成具有重要意义.谷氨酸棒杆菌为重要的氨基酸工业生产菌株,由于缺乏木糖异构酶编码基因而不能代谢木糖.本研究通过质粒过表达不同来源的木糖异构酶基因xyl A,实现了菌株对木糖的利用,其中大肠杆菌木糖异构酶效果最好.由于木糖异构酶的活性是制约菌株代谢木糖的瓶颈因素,因此对启动子的SD序列进行了替换以促进翻译效率,使菌株在木糖培养基中生长的A600值达到出发菌的2.7倍.通过基因组整合3个拷贝的优化后xyl A表达模块,实现了无质粒的木糖代谢工程菌株的构建,为后续谷氨酸棒杆菌利用木糖生产高附加值化学品的代谢工程研究奠定基础.     

瓜氨酸生产相关基因簇在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达

构建1种组成型载体并将载体应用在表达瓜氨酸相关基因簇argCJBDF上。通过去除pXMJ19诱导型启动子上游阻遏蛋白lacI基因的方法,构建组成型质粒pXMJ19-lacI,并将谷氨酸棒杆菌中合成瓜氨酸途径的基因簇argCJBDF克隆到改造过的组成型载体中,实现瓜氨酸合成相关基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌的组成型表达。结果表明:重组菌在30℃摇瓶发酵72 h后,N-乙酰谷氨酸激酶的酶活达到(0.323±0.015)U/mg,瓜氨酸的产量达到4.33 g/L。成功构建的组成型表达载体,实现了外源基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达。     

结核分支杆菌H37Rv莽草酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质的研究

以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,扩增了该菌株的莽草酸脱氢酶基因aroE,通过在大肠杆菌BL21(DE3)pLYS中表达,纯化出可溶性的重组结核分支杆菌莽草酸脱氢酶(SD). 对其酶学性质测定分析表明:在辅酶NADPH作用下该酶可催化还原3-脱氢莽草酸生成莽草酸,最适pH值为11,最适温度为63 ℃,比活性8.26×104 U/mg. Mg2+,Ni2+,Zn2+等金属离子及NP40、TritonX-100等变性剂对其酶活有一定的促进作用,而SDS则强烈抑制该酶活性. 应用圆二色仪初步测定了重组蛋白的二级结构,重组SD的二级结构中大约有29.2%的α螺旋,9.3%β折叠,32.7%β转角,28.8%无规卷曲. 结核分支杆菌H37Rv莽草酸脱氢酶基因的克隆,为该酶的晶体结构分析、免疫学研究及抗结核药物靶点的筛选奠定基础.     

溶氧对谷氨酸棒杆菌发酵产谷氨酸代谢的影响

分别控制0、5%、30%3种溶氧水平进行谷氨酸分批发酵,考察了3种溶氧水平下谷氨酸棒杆菌发酵的代谢响应。结果表明,随着溶氧降低,发酵液中柠檬酸和α-酮戊二酸的含量降低,三羧酸(TCA)循环还原臂途径中的有机酸含量增加,丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸含量也有所增加,在溶氧为0时,乳酸和乙酸大量积累。通过分析不同溶氧水平下的相关酶活和胞内氧化还原状态,发现随着溶氧降低,谷氨酸脱氢酶酶活降低,乳酸脱氢酶酶活升高,胞内氧化还原电势升高,它们的共同作用使氧限制条件下发酵的代谢流流向TCA循环的还原臂途径和乳酸合成途径,导致谷氨酸产量下降。     

萜类化合物生物合成途径中关键酶的研究进展

萜类化合物作为一种广泛存在的天然产物,在植物生命活动中发挥着重要作用,在医药和工业等领域也有着重要应用.它有甲羟戊酸途径和脱氧木酮糖-5-磷酸途径两条生物合成途径,羟甲基戊二酰CoA还原酶、1-脱氧木糖-5-磷酸合酶、1-脱氧木糖-5-磷酸还原异构酶、异戊烯基转移酶及萜烯合酶是这两条途径中调控萜类合成的关键酶.文章综述了这些关键酶基因克隆、表达、分类、作用机制及代谢调控等方面的研究进展.     

柠檬酸钠对L-谷氨酸发酵代谢流迁移的影响

为更全面深入地理解细胞内谷氨酸代谢的调控机制,以黄色短杆菌GDK-9为供试菌株,应用MATLAB软件和代谢流分析方法,定量研究了添加柠檬酸钠后L-谷氨酸发酵中后期胞内的代谢流迁移.在L-谷氨酸发酵中后期添加3.0 g/L柠檬酸钠后.合成副产物L-丙氨酸和乳酸的代谢流量明显减少,分别降低了18.7%和27.4%,EMP途径和乙醛酸循环的代谢流分别减少了0.88和2.12,HMP途径的代谢流增加了0.88,而L-谷氨酸生物合成的代谢流从73.59增长至76.47,较未添加前提高了3.9%.添加柠檬酸钠能使关键节点发生代谢流迁移,提高L-谷氨酸合成中心代谢途径的代谢流量.     

过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L-异亮氨酸合成过程的关键酶,本研究通过在L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶,考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵L-异亮氨酸产量的影响.以L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW基因组为模板克隆hom基因,将hom基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom,再转入C.glutamicum YILW构建C.glutamicumYILW(pXMJ19-hom).通过5,L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L-异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响.结果显示,重组酶的表达使菌株对L-苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强.最终L-异亮氨酸和L-蛋氨酸积累量分别为36.5,g/L和2.8,g/L,分别较出发菌株提高7%和33%,同时L-赖氨酸合成量仅为2.1,g/L,较出发菌株降低了63.8%.     

谷氨酸生产菌的诱变育种

经化学诱变,通过改变谷氨酸棒杆菌B1的代谢途径,筛选出以琥珀酰CoA和乙醛酸为碳源的营养缺陷型,该突变菌株B4的产酸率和转化率分别比出发菌株高11.1%和8.7%.     

通过改变代谢途径选育赖氨酸生产菌株

经化学诱变,通过改变谷氨酸棒杆菌B1代谢途径,筛选出以甘油、丙酮酸和高丝氨酸为碳源的营养缺陷型,该突变菌株B10的产酸率和转化率分别比出发菌株高18.097%和15.56%.     

谷氨酸棒杆菌发酵生产1,5–戊二胺的代谢流分析

为了提高糖类的利用效率,加强糖类代谢向生成尸胺的方向流动,提高尸胺产量,对谷氨酸棒杆菌合成尸胺的代谢网络进行分析,找出影响尸胺合成的代谢流量分配规律和关键节点,并通过改变溶氧及添加辅酶NADPH对关键节点进行验证.结果表明:6–磷酸葡萄糖和丙酮酸是影响碳源流向尸胺合成的关键节点,增强磷酸戊糖途径(HMP)和三羧酸循环(TCA)可以弱化由6–磷酸葡萄糖生成6–磷酸果糖和由丙酮酸生成乳酸,促进碳源向合成尸胺的方向流动,从而有效地提高尸胺产量(产量增幅为77.8%).该研究为高产尸胺的谷氨酸棒杆菌工程菌种改造以及发酵控制提供了理论基础.     

生物酶法合成1,5-戊二胺的研究进展

随着经济的飞速发展,全球每年对聚酰胺、聚氨酯等多聚物产品的需求量呈现逐年增长的趋势。1,5-戊二胺是合成聚酰胺等多聚物的重要单体,生物法合成1,5-戊二胺是一种具有潜在竞争力的绿色环保、资源可持续利用的方法。本文将从代谢途径中的关键酶,大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌以及甲醇芽孢杆菌中戊二胺代谢途径工程改造的最新研究进展4个方面进行综述,并对其前景进行展望。     

谷氨酸棒杆菌生物合成L-鸟氨酸的代谢流分析

应用代谢流平衡模型,通过物料衡算和Matlab线性规划的方法得到谷氨酸棒杆菌1009生物合成L-鸟氨酸的代谢流分布与理想代谢流分布.结果表明:在分批培养条件下,生物合成L-鸟氨酸的过程中,有58.6%的C架进入糖酵解途径,41.4%的C架进入戊糖磷酸途径,L-鸟氨酸的产量达到理论最大产率的65.4%;与理论值相比,应降低三羧酸循环的代谢流,同时减少副产物氨基酸和有机酸的生成.     

谷氨酸棒状杆菌新型诱导启动子的研究

以丰富和完善谷氨酸棒状杆菌的表达元件、筛选适合工业化应用的新型诱导启动子为研究目标,借助绿色荧光蛋白GFP为报告基因,构建启动子筛选工具质粒,在谷氨酸棒杆菌中表达,筛选出三种高效表达的诱导启动子.通过检测绿色荧光蛋白表达强度可知:丙酸启动子诱导表达强度最大,葡萄糖酸启动子次之,蔗糖启动子较弱;丙酸启动子最适诱导浓度为60 ug/m L、葡萄糖酸启动子2 mg/m L、蔗糖启动子2 mg/m L,表达强度比无诱导对照组分别增加4.39、3.86、2.74倍.     

OjCHI真核表达载体的构建及农杆菌的遗传转化

查尔酮异构酶(Chalcone isomerase, CHI)是类黄酮生物合成途径中的第二个关键酶,在类黄酮合成与积累过程中发挥着至关重要的作用。笔者以日本蛇根草为材料,在克隆获得其CHI基因(OjCHI)的基础上,将该基因插入由35S启动子控制的真核表达载体pBI121,完成重组表达质粒pBI121-OjCHI的构建,同时利用冻融法将重组质粒成功转入农杆菌GV3101。该实验的完成可为下一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定基础。     

钝齿棒杆菌B-9有关谷氨酸合成途径的研究

实验测定了B-9菌二级种子和三个发酵时期的无细胞制剂的若干种酶的活性。NADPH联系的谷氨酸脱氢酶、谷丙和谷草转氨酶均有显著活性,种子缺天冬氨酸酶活性。NADPH联系的谷氨酸合成酶活性接近于谷氨酸脱氢酶活性的1/10。谷氨酸合成途径,应以谷氨酸脱氢酶催化的α-酮戊二酸氨化作用为主;但谷氨酸合成酶和天冬酶酸酶也可能参予作用。葡萄糖降解类似于其它生产菌株,通过EMP途径和HMP歧路。存在乙醛酸旁路,α-酮戊二酸氧化活力弱。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和依赖于NADP的苹果酸酶活性均低。     

植物体内的黄酮类化合物代谢及其调控研究进展

针对黄酮类化合物的生物合成、贮存、转运途径、代谢调控因子、合成关键酶及其基因调控等方面的研究现状与进展进行了总结和分析.植物体内黄酮类化合物具有增强植物抗逆性和化学防御功能,在植物的生态适应过程中发挥着积极作用.其种类及含量受植物本身的遗传因素以及环境中生物和非生物因子的影响,可以通过选择或培育合适的种类、改变其遗传特性及环境条件等,调控植物体内黄酮类化合物含量.但关于调控黄酮类化合物的信号分子及其调控途径、各转录因子及蛋白质的调控机理尚未明确,调控黄酮类化合物生物合成的功能基因组或蛋白质组学等领域的研究还有待进一步深入.     

植物体内的黄酮类化合物代谢及其调控研究进展

针对黄酮类化合物的生物合成、贮存、转运途径、代谢调控因子、合成关键酶及其基因调控等方面的研究现状与进展进行了总结和分析.植物体内黄酮类化合物具有增强植物抗逆性和化学防御功能,在植物的生态适应过程中发挥着积极作用.其种类及含量受植物本身的遗传因素以及环境中生物和非生物因子的影响,可以通过选择或培育合适的种类、改变其遗传特性及环境条件等,调控植物体内黄酮类化合物含量.但关于调控黄酮类化合物的信号分子及其调控途径、各转录因子及蛋白质的调控机理尚未明确,调控黄酮类化合物生物合成的功能基因组或蛋白质组学等领域的研究还有待进一步深入.     

克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇代谢途径中的酶活变化

考察了不同条件下克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella.pneumoniae)合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的3种关键酶(甘油脱氢酶(GDH)、1,3-PD氧化还原酶(PDOR)及甘油脱水酶(GDHz))的表观酶活变化。结果显示:这3种酶的酶活变化与Klebsiella.pneumoniae的1,3-PD代谢不完全相关。用SDS-PAGE电泳分析上述不同发酵条件下酶活变化,结果显示不同于3种酶的蛋白条带,Mr约为4.0×104位置的蛋白条带有明显的变化,这可能与菌体代谢过程相关,结论有待进一步深入研究。     

新功能人造生物器件的构建及集成/人工细胞的代谢网络改造与系统优化

该研究采用合成生物学的理念和方法,结合代谢工程的手段,理性设计、构建、优化了埃博霉素在天蓝色链霉菌和紫杉醇、达玛烯二醇在酵母中的异源合成模块。在该研究中,建立了高通量萜类合成途径分析平台。通过基因替换、蛋白表达水平微调控对大肠杆菌MEP途径进行改造,从而构建适合IPP和DMAPP生产的底盘细胞。今年主要的工作为构建大片段DNA合成与组装技术平台,完成了体外全合成全长的简适线粒体DNA分子并完成了测序鉴定。分析了细胞代谢与线粒体形态的变化规律,为日后开展简适线粒体DNA导入后细胞代谢变化分析提供了技术基础。