抗克伦特罗噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选到6个具有CBL结合活性的噬菌体scFv,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础.     

从噬菌体抗体库中淘选人绒毛膜促性腺激素的单链抗体

由鼠源噬菌体抗体库淘选到展示有人绒毛膜促性腺激素单链抗体的噬菌体克隆。用ELISA方法进行检测,从结合力最强的克隆中分离单链抗体基因,插入经改造的高效表达载体pET-21a(+)中,转化大肠杆菌,诱导表达。从培养基中可检测到可溶性抗人绒毛膜促性腺激素的单链抗体。     

抗弓形虫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

采用弓形虫可溶性抗原攻击的小鼠,取小鼠脾脏从中提取细胞总RNA,通过RT-PCR扩增鼠源抗体VH和VL基因,并采用重叠PCR (SOE-PCR)方法构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载体pCANTAB5E中,转化于感受态大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.从20个噬菌体克隆中筛选到15个具...     

EL-4荷瘤鼠单链噬菌体抗体库的构建

目的:构建一个EL-4荷瘤鼠的单链噬菌体抗体库,为筛选高特异性和高亲和力的单链抗体做准备.方法:于C57小鼠腋区接种EL-4细胞,待肿瘤长大后,从脾细胞中提取总RNA,RT-PCR技术扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因(VH、VL),用Linker奖VH和VL基因连成单链抗体可变区片段(scFv).双酶切后(Not Ⅰ、Sfi Ⅰ)与预备好的pCANTAB5E噬粒载体连接,转化入感受态TG1,构建EL-4荷瘤鼠的单链噬茵体抗体库.随机抽取转化后的20个克隆,用以检测外源DNA的转入情况.结果:PCR扩增出的VH约有340bp和VL约有320bp,scFv的长度约有750bp.转化后的TG1约有1.67×107个茵落,随机挑取20个克隆,双酶切显示五分之一的茵落转化了外源DNA片段,有效库容为3.34×106.结论:成功构建了EL-4荷瘤鼠的单链噬茵体抗体库.     

鼠源抗AFB1噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

研究以AFB1-BSA免疫的小鼠脾脏细胞为试验材料,利用RT-PCR技术,克隆了抗AFB1抗体重链和轻链可变区基因VH和VL,利用连接肽(Gly4Ser)3将VH和VL链接成单链抗体基因scFv,通过噬菌体展示载体pCANTAB-5E携带将其电转化E.coli TG1,经氨苄青霉素平板筛选,构建了库容为2.13×109 cfu/μg DNA的噬菌体单链抗体库,抗体库的克隆阳性率达到100%,且多样性良好,为高活性抗AFB1单链抗体的筛选提供了材料基础。     

抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选

利用噬菌体展示技术进行纳米抗体库的构建和筛选,获得抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,为相关癌症诊断及靶向治疗的应用奠定基础。使用重组CEACAM5抗原免疫羊驼,分离免疫后羊驼的外周血淋巴细胞,提取总RNA后通过RT-PCR技术扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)片段,构建纳米抗体文库。采用噬菌体展示技术和固相淘选方法,筛选得到强阳性克隆,经大肠杆菌表达和镍离子亲和层析获得纳米抗体,最终利用Biacore分析其亲和力和特异性。通过3轮的淘选,获得一株纳米抗体亲和力达到2.6×10-10mol·L-1,对同源性蛋白CEACAM-1、-3、-6、-8及肿瘤蛋白AFP均无交叉反应性。利用噬菌体展示技术成功获得了抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,可用于后续相关癌症诊断和靶向治疗。     

小鼠噬菌体抗体库的构建和N-肽结合单链抗体的筛选

成功构建一库容量为1.7×10⁸的小鼠噬菌体抗体库,并从中淘选出对N-肽有结合活性的单链抗体。首先从未免疫小鼠的脾脏中提取总RNA,分离出mRNA,经逆转录合成其总cDNA。随后通过PCR分别扩增出抗体重链和轻链可变区V_H、V_L的基因片断,再经重组PCR将两片断由一编码(Gly₄Ser)₃十五肽的接头连在一起,并克隆到噬菌质粒pCANTAB 5E中,电击转化大肠杆菌TG1。经辅助噬菌体M13KO7超感染回收全部重组噬菌体,此即噬菌体抗体库。N-肽是一种新发现的神经肽,其N端与阿片肽高度同源,可与阿片肽受体相互作用。对其研究可能有助于了解成瘾机制和有临床应用价值。将生物素化的N-肽与抗体库相互作用,用偶联有链霉亲和素的磁珠富集与N-肽结合的重组噬菌体,经四轮淘选,得到亲和力较高的单链抗体。     

丙溴磷人源ScFv抗体的筛选与鉴定

采用菌噬体表面展示技术,以丙溴磷（profenofos）为固相包被抗原,从半合成的菌噬体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原特异性和结合性较强的丙溴磷人源单链可变区抗体（ScFv）片段,片段为780 bp,免疫学检测结果表明阳性克隆株具有特异结合丙溴磷抗原的生物学活性.并对6株编码ScFv的序列进行了基因组序列测定及BLA ST分析,结果表明该抗体基因序列VH属于IGHV 1、VL属于IGLV 3,证明是新的抗体基因序列.     

噬菌体显示抗乳腺癌单链抗体的基因克隆和筛选

克隆和连接乳腺癌杂交瘤单克隆抗体的轻、重链可变区基因，构建该单链抗体的噬菌体显示系统，经严格的相关肿瘤细胞株的固相细胞正负筛选和多步液相结合-洗脱细胞筛选，得到特异性高、亲和力强的单链抗体基因，用于进一步构建重组免疫毒素，为临床乳腺癌和生物靶向治疗奠定基础.     

人源性抗HBc单链噬菌体抗体库的构建

利用RT－PCR和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体（抗HBc）阳性患淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体（ScFv）基因，重组于噬菌粒载体pHEN1，转化抑制型大肠杆菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。库容量达106。     

Isolation by phage display and characterization of a single-chain antibody specific for O6-methyldeoxyguanosine

New approaches of making single chain Fv antibodies against O⁶-methyl-2′-deoxyguanosine (O⁶MdG) have been demonstrated by using the phage antibody display system. Using O⁶MdG as an antigen, 21 positive clones were identified by ELISA from this library, one of which, designated H3, specifically binds to O⁶MdG with high affinity. The H3 scFv antibody has an affinity constant (K_aff) of 5.94×10O¹¹(mol/L)^-1. H3 scFv has been successfully used to detect O⁶MdG in DNA hydrolyses from yeast or E. coli cells treated with a DNA methylating agent. To our knowledge, this is the first report of the selection of a specific scFv against DNA adducts. The results demonstrate the potential applications of the phage display technology for the detection of DNA lesions caused by mutagens and carcinogens.     

从噬菌体展示七肽肽库筛选α-淀粉酶特异性配体

为了建立蛋白质亲和配基的高效筛选方法，以淀粉酶为靶分子，利用交替洗脱法从七肽噬茵体展示库中筛选具有高亲和力的噬茵体配体．结果表明，交替洗脱法筛选出的特异性配体的回收率和ELISA信号值均优于酸洗脱法；采用交替洗脱法能够更加有效和迅速地筛选到淀粉酶的高亲和力配体．分析筛选得到的不同噬茵体克隆DNA插入片断的氨基酸序列，发现了可能与配体高亲和性有关的氨基酸残基．     

亲环素A抗原表位在三维结构中的初步定位

以抗人亲环素A单克隆抗体D4作捕获抗体，用噬菌体展示库鉴定出亲环素A模拟抗原表位的氨基酸序列为WSLQSFL，在亲环素A的一级结构中没有相同的序列，提示亲环素A抗原表位为构象型的，亲环素A的三维空间结构已测定，利用RasMol等蛋白质三维结构观察软件，可以初步确定亲环素A的抗原表位的时间位置，此抗原表位与环孢素的结合位点有重叠。     

应用噬菌体随机肽库研究抗溶藻弧菌及其外膜蛋白单抗识别的特异性表位

用噬菌体随机七肽库筛选制备的抗溶藻弧菌及其外膜蛋白的纯化单抗，经3轮淘洗，获得较高程度富集的噬菌体，效价较高，第3轮淘洗比第1轮淘洗的产量高出近百倍。同时获得的阳性噬菌体经ELISA检测能与Va抗原发生强的阳性反应，确证了淘洗筛选的结果。     

应用毛细管电泳表征噬菌体与丹酚酸B的相互作用

基于Hummel-Dreyer毛细管电泳方法研究经噬菌体展示库生物淘洗亲和筛选出的噬菌体和丹酚酸B之间的结合作用,结合系数由PRISM软件中Scatchard方程曲线拟合计算得出.实验结果表明,筛选出的该噬菌体克隆的表面蛋白和丹酚酸B具有特异性的结合作用,也说明利用毛细管电泳测定噬菌体和丹酚酸B的结合系数是可行的.     

Construction of Large Human Single—chain Antibody Phage Display Library

A large human naive single chain antibody (scFv) library is constructed from 60 healthy donors via phage display technique.During the period,some methods are employed to optimize the diversity,such as multi donors,different annealing temperature,half-nest PCR.and assembly by two-way fusion PCR.In this study,78 electroporations resulted in 1010 library,diversity of which is assayed by enzyme fingerprint.The efficiency and diversity are all better than other researches.     

抗口蹄疫病毒phage-scFv及可溶性scFv的构建

利用重组DNA技术在抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C 7 VH基因和VL基因之间导入一段连接肽[(G ly4Ser)3],采用重叠延伸拼接法,经聚合酶链反应(PCR)扩增获得scF v基因。将scF v基因克隆至噬菌粒pCANTAB 5E载体,转化E.coli TG 1,构建噬菌体抗体文库。用M 13KO 7辅助噬菌体挽救及固相口蹄疫病毒(FMDV)抗原对噬菌体抗体文库的三轮“吸附-洗脱-扩增”的淘洗,筛选出scFv阳性克隆。将阳性克隆转化E.coli BH 2151,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导可溶性scFv蛋白的表达。酶联免疫吸附实验(EL ISA)检测表明:scFv克隆表达的phage-scFv及可溶性scFv与FMDV亲和力高,特异性强。     

A Co—expression System Based on Phage and Phagemid to Select Cognate Antibody—antigen Pairs in vivo

A modified selectively-infective phage(SIP) is developed to facilitate the selection of interacting antibody-antigen paris from a large single-chan antibody(scFv)library in vivo.The system is constructed with a modified helper phage M13KO7 and phagemid pCANTAB 5E.The antigen fused to the C-terminal of N1-N2 domain and the scFv to the N-terminal of CT domain of the gIIIp of filamentous phage are encoded on the phage and phagemid vectors respectively.The phages produced by co-transformants restore infectivity via interaction between antigen and antibody fusions in the cell periplasm.In a model system,the scFv fragment of the anti-hemagglutinin 17/9 antibody and its corresponding antigen are detected in the presence of a 10^5 fold excess of a non-interacting cotrol paris,which demonstrates this system to be very sensitive and facile to screen a large single-chain antibody library.