溶藻弧菌TssJ基因的原核表达及多克隆抗体制备

Tss J是溶藻弧菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)的一个重要基因.为了制备Tss J基因的多克隆抗体,以溶藻弧菌HN08155菌株的DNA为模板,扩增Tss J基因后利用表达载体PET-32a(+)和大肠杆菌BL21(DE3)原核表达,分离纯化后免疫大鼠获得Tss J基因的多克隆抗体.结果显示,37℃、IPTG终浓度1 mmol·L~(-1)是较适宜的表达诱导条件,表达的融合蛋白是存在于细胞内的包涵体,与预期的分子量42 k D一致,并且免疫大鼠后血清的多克隆抗体效价很高,为1∶32 768.制备的溶藻弧菌Tss J高效价多克隆抗体有助于进一步开展Tss J的定位和功能研究.     

卵形鲳鲹TNFSF6的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了研究卵形鲳鲹肿瘤坏死因子配体6(TNFSF6)的功能,本研究构建了TNFSF6的原核表达载体并制备了其多克隆抗体,首先通过PCR扩增技术扩增获得了TroTNFSF6的开放阅读框序列,并构建了原核表达重组质粒pET-TroTNFSF6,随后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,进行原核表达并获得重组蛋白rTroTNFSF6.结果显示,重组蛋白rTroTNFSF6大小约46.5 kDa,其最适诱导温度为20℃,诱导时间为8 h,IPTG的最佳浓度为0.6 mmol/L.可溶性分析表明,重组蛋白rTroTNFSF6主要在沉淀中,以包涵体的形式存在.将纯化后的重组蛋白rTroTNFSF6免疫小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测结果表明其效价高达1∶32 000.本研究为进一步探究卵形鲳鲹TNFSF6的功能奠定了基础.     

恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

原核表达恶性疟原虫多期多表位基因并制备其多克隆抗体。在前期构建恶性疟原虫复合多期多表位重组真核表达载体的基础上,将测序正确的AMAMEG基因克隆入原核表达载体pGEX4T—1并诱导表达。采用包涵体洗涤的方式纯化目的蛋白,以AMA—1抗体对纯化蛋白进行Western—blot分析。将纯化的融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过PCR成功获得长度为1 000 bp的恶性疟原虫AMA—1胞外域基因片段,获得了与多表位基因连接后的AMAMEG基因。通过诱导表达,显示在相对分子量约95 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白。经此纯化的融合蛋白免疫的小鼠能产生特异性抗体,其滴度达到1∶105。纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型疟疾疫苗奠定一定的理论和实践基础。     

小鼠肥大细胞蛋白酶4的原核表达和多克隆抗体制备

文章构建小鼠肥大细胞蛋白酶4（mMCP-4）原核表达体系,获得原核表达蛋白,并制备兔抗mMCP-4多克隆抗体,提取小鼠脾细胞总 RNA ,运用 RT-PCR技术获得目的基因 mMCP-4,构建重组原核表达载体pET28a-mMCP-4,将其转化到大肠杆菌BL21中诱导表达。mMCP-4融合蛋白经Ni亲和层析法纯化后,作为抗原免疫兔子获得mMCP-4多克隆抗体。采用ELISA法测抗体效价,western blot检测抗体特异性。结果表明,构建重组表达质粒pET28a-mMCP-4,经大规模原核表达获得大量mMCP-4融合蛋白,制备的兔抗血清效价达1∶128000,并表现出较好特异性。研究结果为进一步研究mMCP-4生物学功能奠定了基础。     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

截短型HCV NS5B RNA聚合酶在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达NS5B蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化NS5B蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV NS5B RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

GST-SDF-1α融合蛋白的原核表达及纯化

构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达蛋白以获得大量重组融合蛋白。通过PCR方法扩增出小鼠SDF-1α基因,克隆入pMD18T载体中,进行测序分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T11中GST的下游构建重组质粒pGEX-4T1-SDF-1α,转化受态细胞BL21中,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测分析。在约Mr36×103处出现一新生的蛋白条带。经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后得到了目的蛋白。成功克隆了小鼠的SDF-1α基因,并纯化融合基因GST-SDF-1α的原核表达产物。     

细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了表达、纯化细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白及制备多克隆抗体,本研究构建细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白原核表达载体p ET30a-M26,转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达,SDS-PAGE切胶纯化的副肌球蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用Western blotting和ELISA对副肌球蛋白及抗体进行检测。结果显示:成功表达并纯化了细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白,重组蛋白分子质量约41 k D,纯化后目的蛋白纯度可达85%,蛋白浓度为0.5mg/ml。副肌球蛋白可与所制备的多克隆抗体结合,ELISA测定的抗体效价为1∶12800,结果表明,成功表达并纯化了六钩蚴副肌球蛋白。本研究可为研究包虫病早期诊断奠定了基础。     

卵形鲳鲹Hepcidin-5的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了制备高效的卵形鲳鲹hepcidin-5蛋白多克隆抗体和对其特异性进行鉴定,本研究通过PCR扩增的方法获得了卵形鲳鲹抗菌肽hepcidin-5(Tro H5)的成熟肽cDNA序列,并构建了原核表达载体pET-32a(+)/TroH5,然后将其转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行原核表达.经IPTG诱导,成功表达了相对分子质量约为35kDa的融合重组蛋白.经不同诱导条件的优化,最终确定在IPTG终浓度为0. 1mmol/L和温度为20℃时,其表达量最大.可溶性分析表明:该融合蛋白主要存在于上清中.经镍柱亲和层析纯化获得了纯度较高的融合蛋白,然后以免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA法检测,其效价达到1∶105.蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明:所制备的多克隆抗体特异性强.本研究为进一步探究hepcidin-5的生物学功能奠定了基础.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

小鼠附睾特异性辅脂酶的原核表达及其抗体的制备

目的:利用原核表达系统重组表达小鼠附睾特异性辅脂酶(meClps),并制备抗meClps抗体。方法:通过生物信息分析meClps蛋白结构,Oligo 6设计引物,PCR法从小鼠附睾cDNA中扩增meClps全长序列并克隆到pMD19-T载体中。将含meClps序列pMD19-T载体通过PCR扩增成熟肽区段序列,重组到pET-21b原核表达载体上,经菌落PCR及测序鉴定后,转化到表达菌株E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达后用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting检测重组meClps的表达。包涵体沉淀经浓度为2 mol/L尿素洗涤,Tricine-SDS-PAGE分离、染色、脱色,切下目的条带用生理盐水浸泡、磨碎与弗氏佐剂混合后免疫新西兰大白兔获取免疫血清,Western blotting检测抗体与meClps反应。结果:在原核表达系统成功重组表达meClps,目的蛋白主要以包涵体形式存在,制备了高效价的兔抗meClps抗体。结论:成功建立meClps的原核表达系统和获得兔抗meClps抗体。     

利用多克隆抗体检测纺锤体蛋白基因INAIAP在肝癌细胞中的表达

为探究纺锤体蛋白INMAP的功能及其在细胞恶性增殖中发挥的作用,制备INMAP多克隆抗体。利用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导His-INMAP融合蛋白进行原核表达,SDS-PAGE及免疫印迹检测蛋白表达。4.0 mol/L尿素处理包涵体获得可溶性融合蛋白,镍亲和柱分离纯化融合蛋白抗原并检测蛋白浓度及纯度。以所获抗原免疫4只Balb/c小鼠,收集心脏抗血清。以纯化前、后的原核表达产物作为抗原,检测INMAP多克隆抗体的特异性。通过免疫印迹分析INMAP在正常肝细胞系L-02及5个肝癌细胞系(PLC、Hep G2、SUN449、SMMC-7721和BEL-7402)中的表达差异。结果显示,His-INMAP融合蛋白主要以包涵体形式存在,经4.0 mol/L尿素处理可获得可溶性目的蛋白,且纯化后的抗原纯度较高(94.1%)。INMAP多克隆抗体能与INMAP抗原特异结合。INMAP在6种肝细胞中具有多态性,除PLC外,在其他肝癌细胞中其基因表达水平显著下调。本研究制备的INMAP多克隆抗体特异性高,为INMAP基因功能的进一步研究奠定了基础。     

克氏原螯虾主要变应原原肌球蛋白的一个片段区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

克隆克氏原螯虾主要过敏原原肌球蛋白的一个片段区基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫原性.提取克氏原螯虾总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆得到目的基因;将目的基因连入pMD19-T载体,提质粒酶切鉴定并测序;将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;利用Western-blotting和ELISA检测该重组蛋白的免疫原性.克隆获得目的基因,其片段长为291 bp,编码97个氨基酸.重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western-blotting和ELISA结果表明该蛋白与克氏原螯虾过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性.     

利用多克隆抗体检测纺锤体蛋白基因INMAP在肝癌细胞中的表达

 为探究纺锤体蛋白INMAP 的功能及其在细胞恶性增殖中发挥的作用,制备INMAP 多克隆抗体.利用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导His-INMAP 融合蛋白进行原核表达,SDS-PAGE 及免疫印迹检测蛋白表达.4.0 mol/L 尿素处理包涵体获得可溶性融合蛋白,镍亲和柱分离纯化融合蛋白抗原并检测蛋白浓度及纯度.以所获抗原免疫4 只Balb/c 小鼠,收集心脏抗血清.以纯化前、后的原核表达产物作为抗原,检测INMAP 多克隆抗体的特异性.通过免疫印迹分析INMAP 在正常肝细胞系L-02 及5个肝癌细胞系(PLC、HepG2、SUN449、SMMC-7721 和BEL-7402)中的表达差异.结果显示,His-INMAP 融合蛋白主要以包涵体形式存在,经4.0 mol/L 尿素处理可获得可溶性目的蛋白,且纯化后的抗原纯度较高(94.1%).INMAP 多克隆抗体能与INMAP 抗原特异结合.INMAP 在6 种肝细胞中具有多态性,除PLC 外,在其他肝癌细胞中其基因表达水平显著下调.本研究制备的INMAP 多克隆抗体特异性高,为INMAP 基因功能的进一步研究奠定了基础.     

Rab39A多克隆抗体的制备与鉴定

制备抗人Rab39A多克隆抗体并进行纯化检测,以用于Rab39A功能的研究.选取免疫原性强且特异性高的羧基端42个氨基酸(176～217aa)作为目的片段.PCR法扩增并构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rab39C42.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化GST-Rab39C42融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.然后以亲和层析法纯化抗体,利用Western blot和免疫荧光检测抗体的特异性.结果表明,构建的原核表达载体经IPTG诱导后高效表达GST-Rab39C42蛋白,纯化后抗体质量浓度为1μg/μL;Western blot实验显示,抗体可以识别外源Rab39A蛋白和多个细胞系的内源Rab39A蛋白;抗体中和实验和RNA干扰实验证明了该抗体具有特异性.本研究成功构建了pGEX-4T-1-Rab39C42原核表达载体,并制备了特异性的抗人Rab39A兔多克隆抗体,为进一步研究Rab39A的功能提供了有力的支持.     

日本蛇根草CHI基因原核表达载体的构建及重组蛋白的纯化

在克隆得到日本蛇根草查尔酮异构酶基因(OjCHI 702 bp)的基础上,完成OjCHI原核表达载体p ET32aCHI的构建,并对OjCHI可溶性重组蛋白的诱导表达条件进行摸索。结果显示,OjCHI可溶性重组蛋白的诱导表达条件为:IPTG浓度0.35 mmol/L,30℃下诱导10 h。按照上述条件制备并纯化获得大量符合预期大小(45.018KD)的OjCHI可溶性重组蛋白,该结果为后续研究OjCHI基因的生物学功能奠定了基础。     

人A组轮状病毒结构蛋白VP7原核表达及其卵黄抗体效价的研究

为获得人A组轮状病毒重组结构蛋白VP7及其高效价的卵黄抗体,使用PCR技术扩增VP7 DNA片段并将其克隆到原核表达载体pET28a上形成重组质粒pET28a-VP7。将重组质粒转化基因工程菌E.Coil BL21(DE3),用0.5 mM IPTG诱导VP7重组蛋白的表达。通过包涵体纯化和蛋白复性后,将VP7重组蛋白与弗氏佐剂混匀免疫产蛋鸡,收集鸡蛋。用水稀释-盐析法纯化卵黄抗体IgY。进一步应用SDS-PAGE、ELISA和点杂交技术,分析该卵黄抗体的纯度、效价和特异性。结果表明在基因工程菌E.coli BL21(DE3)中能够实现VP7重组抗原的表达,将重组抗原VP7免疫产蛋鸡,提取纯化得到滴度为1:100 000的抗VP7卵黄抗体,且特异性的识别野生型A组轮状病毒。     

Myostatin基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化与鉴定

应用基因工程技术,将合成Myostatin C-末端区(330bp)的基因序列,克隆至原核表达载体pQE30,以构建人的Myostatin基因原核表达载体.构建的重组质粒pQE-Ms转染大肠杆菌宿主菌DH5α后,IPTG诱导表达重组蛋白.应用SDS-PAGE电泳和Western Blot分析和鉴定了重组蛋白的特异性,并用镍离子亲和色谱柱层析进行目的蛋白的纯化与鉴定.结果表明:重组质粒pQE-Ms酶切和测序结果与预期相符,SDS-PAGE电泳和Western Blot证实表达蛋白为目的蛋白,蛋白表达形式为包涵体,经镍离子螯合亲和层析柱纯化及鉴定,确定实验获得了高纯度的目的蛋白,为人体血清中Myostatin蛋白表达的检测及特异性抗体制备等研究提供了实验依据.