用蛋白质印迹技术检测马槟榔甜蛋白

从马槟榔（ＣａｐｐａｒｉｓｍａｓａｉｋａｉＬ．）种子中分离纯化了马槟榔甜蛋白，并对其氨基酸组成和紫外吸收光谱等理化性质进行了分析测定。用纯化的马槟榔甜蛋白免疫家兔，获得其抗血清，并利用此抗血清通过蛋白质印迹技术检测马槟榔甜蛋白，为马槟榔甜蛋白的基因工程研究提供了专一和灵敏的检测方法。     

浅谈蛋白质印迹法操作过程中的实验技巧

蛋白质印迹法(蛋白免疫印迹)即Western Blot,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。其基本原理是将电泳分离后的细胞或组织蛋白从凝胶转移到固相支持物上,然后用特异性抗体对相应抗原进行着色,随后通过分析着色的位置和着色深度来反映蛋白质表达情况。该文通过介绍实验操作过程中的一些心得体会,简要阐述如何提高蛋白质印迹法的实验效果。     

重组SARS冠状病毒S蛋白的原核表达研究

目的克隆表达SARS冠状病毒的主要结构蛋白(S蛋白)。方法合成SARS冠状病毒S蛋白特异性基因片断并克隆入pET32a原核表达载体,转化BL21菌,经IPTG诱导高效表达得到重组S蛋白,并通过W estern印迹对重组蛋白质进行鉴定。结果重组蛋白质经镍柱亲和层析得到了部分纯化,免疫动物后得到SARS病毒的多克隆抗体。结论经E lisa检测,表达的重组S蛋白基本具备检测病人血清中抗SARS病毒IgG和IgM的能力,可进一步用于S蛋白功能研究与SARS诊断试剂盒的研制。     

小PVDF膜转移蛋白印迹及其凝胶电泳玻璃板的改进

该文对蛋白印迹技术有关操作实验优化进行了报道,在蛋白印迹实验中,蛋白质样本经凝胶电泳后,根据检测目的蛋白质分子量的位置,该文利用小PVDF膜转移蛋白,考马斯亮蓝染色观察,发现小膜转移具有节约资源和方便操作的优点。此外,为了解决蛋白印迹实验中部分操作、表述和交流中的问题,该文在凝胶电泳玻璃板中央设计了纵横相交的标尺刻度。实践表明,此设计有利于完善与凝胶电泳相关的生物医学分析手段。     

结核分支杆菌H37Rv株抗原成份分析

通过免疫印迹技术（Western blotting），用结核杆菌的单克隆抗体及兔抗结核菌多克隆抗体对结核分支杆菌H37Rv的菌体蛋白和培养液蛋白成份进行了初步分析，发现固体培养菌与液体培养菌的菌体具有基本一致的多肽抗原成份，而培养液中的抗原成份与前两者差异稍大。通过筛选和鏊定结核分枝杆菌的特异性和保护性抗原，研究结核杆菌的免疫反应特点，为探索结核病的诊断和治疗的新途径奠定了一定的基础。     

日本血吸虫童虫在东方田鼠和昆明小鼠中的蛋白差异初探

东方田鼠具有天然抗日本血吸虫活性,为了筛选抗日本血吸虫疫苗分子,通过日本血吸虫尾蚴感染东方田鼠和昆明小鼠,感染11天后收集东方田鼠和昆明小鼠肝童虫．肝童虫经组织匀浆收集蛋白质并进行蛋白质定量后SDS-PAGE分离,切取差异蛋白条带进行蛋白质鉴定．发现差异蛋白主要为日本血吸虫结构蛋白,能量代谢相关蛋白以及热休克蛋白等．为进一步研究抗日本血吸虫疫苗奠定了基础．     

结合适配体技术的磁性粒子表面蛋白分子印迹材料研制

本文将具有高度特异性的生物分子核酸适配体引入分子印迹技术,并结合磁性纳米粒子材料比表面积大、操作简便性和易于修饰性于一体,制备出了新型蛋白分子印迹材料.首先获得性能更好的硅烷化的磁性微球,之后加入功能单体、交联剂和衍生化适配体,以溶菌酶为模板分子,制备出磁性溶菌酶蛋白分子印迹适配体-纳米粒子.实验结果显示,不同材料的蛋白吸附能力顺序由高到低分别为结合适配体的蛋白印迹材料,结合适配体的非蛋白印记材料,蛋白印迹材料和无适配体的非蛋白分子印记材料.初步研究表明,适配体与磁性粒子的结合可以有效提高蛋白质分子印迹材料的印迹效果.     

多头绒泡菌线粒体中肌动蛋白的免疫细胞化学鉴定

自多头绒泡菌(Physarum polycephalum Schw.)原质团中分离线粒体,以兔抗肌动蛋白抗体为一抗,荧光素标记的羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作二抗进行间接免疫荧光和蛋白质免疫印迹实验.结果显示,线粒体中含有与肌动蛋白抗体呈阳性反应的抗原.以兔抗肌动蛋白抗体作一抗,金颗粒标记的蛋白A作二抗进行的间接免疫电子显微镜实验结果进一步证明了肌动蛋白是多头绒泡菌线粒体的组成成分,并在线粒体中呈散在分布.     

食管鳞癌淋巴结转移的蛋白质组分析

分析食管鳞癌转移淋巴结中鳞癌细胞与食管鳞癌组织中鳞癌细胞的蛋白质的表达差异,获取鉴别两者的分子标志物。用激光捕获显微切割技术分离出食管鳞癌转移淋巴结和食管鳞癌组织中较纯的鳞癌细胞,运用双向电泳和质谱的方法检测两者表达的差异蛋白,并用免疫印迹技术对差异候选蛋白进行分析、验证。发现29个差异蛋白点,通过质谱鉴定出6种有意义的蛋白,转移淋巴结中的鳞癌细胞中如peroxiredoxin 1等5种蛋白表达明显增高,1种蛋白MTCBP-1表达下调。因此激光捕获显微切割可以有效地解决组织异质性的问题;食管鳞癌组织中的鳞癌细胞与转移淋巴结中的鳞癌细胞的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,提示食管鳞癌的淋巴结转移过程的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果,从而造成肿瘤细胞迁移性和侵袭性的进一步增强。     

乙型肝炎病毒促进肝细胞PD-L1蛋白表达机理

为了研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)能否借助肿瘤细胞的抗免疫机制来逃逸机体免疫,利用HBV感染去肝细胞,研究受感染后的肝细胞对宿主免疫应答的变化.通过实时荧光定量PCR的方法分析HBV感染后的肝细胞内Axin和PD-L1的转录水平,发现HBV不影响Axin和PD-L1的转录水平,采用蛋白免疫印迹技术发现HBV能下调肝细胞内Axin蛋白水平,同时上调PD-L1蛋白水平.进一步在细胞内转染表达HBV的组成蛋白的质粒,通过蛋白免疫印迹技术发现HBV的组成蛋白HBx能下调细胞内Axin蛋白的表达.通过数据相关性分析以及泛素化实验发现,Axin能通过增加PD-L1的E3泛素连接酶SPOP的表达,促进PD-L1泛素蛋白酶体降解.进一步对PD-L1的泛素化方式进行探讨,发现Axin促进PD-L1的K48依赖的泛素化降解作用.结果表明,HBV可能通过HBx下调Axin和SPOP蛋白水平,抑制PD-L1泛素化降解,进而逃逸宿主免疫应答.本研究揭示了HBV免疫逃逸新机制,为治疗HBV奠定了新的基础,在一定程度上推动了抗HBV药物开发.     

草履虫的类中间纤维以免疫学方法进行的初步研究

以抗中间纤维蛋白抗体作为探针进行免疫荧光实验,得到细胞内不同部位的阳性反应,暗示原生质中可能存在类中间纤维。这些同源蛋白的胞内分布具有一定的规律性。进一步采用SDS-PAGE和免疫印迹技术研究它们的生化性质,发现4种主要蛋白明显有别于胞内其他蛋白组分。它们是21,23,33及68kD蛋白。在免疫印迹实验中,4种蛋白中的一种或几种分别与不同的中间纤维蛋白抗体有交叉反应。以上实验初步表明,草履虫细胞内存在高等生物中间纤维蛋白的同源蛋白。     

纯化抗原半定量检测幽门螺杆菌感染

目的：鉴定并提取幽站螺杆菌（Ｈｐ）特异性抗Ｈｐ抗体的半定量免疫酶技术。方法：１０株Ｈｐ可溶性蛋白用于十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析，凝胶怪析提取特异性抗原，方阵滴定建立免疫酶方法。纯化怕与全菌抗原同批检测１３６例患，以免疫印迹分析作为金标准。结果：Ｈｐ主要特异性怕分子量为６６０００，６９０００，３１０００和２５０００，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００柱层析第１提取物含其中三种怕成分。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳——曙红Y染色法

十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳已广泛用于分子生物学和医学临床等领域,但该技术的染色方法多沿用考马斯亮蓝和银染色,这两种方法均有其局限性,如蛋白凝胶染色前须经酸或醛固定,不易洗脱且操作繁琐,脱色耗时等。而曙红Y染色具有检测灵敏度高,操作简便,染色时间短,可对各种蛋白质染色,染色后的蛋白质可直接进行电泳转移印迹,也可将凝胶中蛋白质电泳转移后染色。染色后的蛋白质仍具有抗原性。此外,还具有试剂便宜,使用安全,便于推广应用等优点。     

伤寒沙门菌激活TRAIL信号通路促进巨噬细胞凋亡

为探究伤寒沙门菌对巨噬细胞凋亡及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)信号通路的影响,对伤寒沙门菌感染THP-1细胞早期和后期提取细胞RNA进行转录组测序(RNA-seq).通过定量PCR(qPCR)技术检测凋亡相关基因的转录水平,对RNA-seq结果进行验证,流式细胞术和蛋白质免疫印迹法检测THP-1细胞的凋亡和凋亡相关蛋白;加入TRAIL抗体结合TRAIL蛋白后,流式细胞术和蛋白质免疫印迹法检测感染早期THP-1细胞凋亡的变化.结果显示,伤寒沙门菌感染THP-1细胞后,凋亡相关基因caspase-3、caspase-8、caspase-9在感染后期转录水平显著增加,Tnfsf10、Tnfrsf10b、Tnf、Fas在感染早期和后期转录均增加,细胞凋亡率明显增加,caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白活化增加,TRAIL、DR5蛋白表达增加;与PBS对照组相比,加入TRAIL抗体后caspase-3蛋白活化明显减弱,细胞凋亡率明显下降.综上,伤寒沙门菌通过部分激活TRAIL信号通路来诱导巨噬细胞凋亡.     

新型T+1断裂蛋白质内含子的构建

首次从天然C端外显子为苏氨酸(Thr)的标准蛋白质内含子(TerSnf2)构建出两类T+1型断裂蛋白质内含子:Snf-S0和Snf-S1,通过蛋白印迹法测定Snf-S0和Snf-S1介导的蛋白质反式剪接效率分别达到53.5%和33.3%;当这两类断裂蛋白质内含子C端外显子分别为半胱氨酸(Cys)和丝氨酸(Ser)时均具有剪接活性.所获的两类具有剪接活性的T+1型断裂蛋白质内含子具备一定的插入位点通用性,这一特点为蛋白质反式剪接技术在蛋白质工程领域广泛应用提供了新的契机.     

印迹膜测序法分析结核分枝杆菌抗原蛋白

把WesternBlot技术分析抗原抗体反应的高度特异性与用PVDF膜作载体进行蛋白质氨基酸序列分析的高度敏感性相结合对结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,TB)的特异性、保护性抗原进行筛选和分析鉴定 ,获得了分子量为 31KDa、30KDa的抗原 这两种抗原与抗结核分枝杆菌的单克隆抗体和结核病人血清均发生阳性反应 ,而与正常小鼠血清和健康人血清呈阴性反应 用印迹膜测序法测出 31KDa抗原蛋白的N 末端序列为AlaGluValAspTrpLeuValPheAlaValSerTrpProValGly ,30KDa蛋白序列为PheSerArgProGlyLeuProValGluTry 印迹膜测序为分子生物学研究提供了一种有效的新途径     

溴氰菊酯抗感品系小菜蛾成虫差异表达蛋白的鉴定

通过对小菜蛾Plutella xylostella(L.)抗溴氰菊酯品系和敏感品系成虫双向电泳图谱的比较,找到8个差异明显的点,并结合质谱分析技术和数据库信息检索最终鉴定出7个蛋白.其中包括2个代谢相关蛋白,2个调控蛋白,1个结构分子蛋白,其余2个蛋白质功能皆不明确.这些在抗性或敏感品系中差异表达蛋白质的发现,为进一步研究小菜蛾抗药性形成机制和抗性相关蛋白的寻找奠定了基础.     

白斑综合征中国对虾肝胰腺蛋白质组学研究的技术探索

建立白斑综合征中国对虾肝胰腺蛋白质组学技术体系，以患白斑综合征中国对虾的肝胰腺为研究对象，健康中国对虾肝胰腺为对照组,探索2种蛋白质组学差异蛋白的分离和鉴定的方法. 采用双向凝胶电泳(4～7固相pH梯度干胶条，10%SDS-PAGE)分离蛋白质组，银染显色，图像分析软件比较分析，识别差异蛋白，胶上扣点，处理后通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MOLDI-TOF）得到肽质量指纹图谱，软件分析后应用Mascot数据库搜索软件鉴定蛋白. 分别获得中国对虾患白斑病组及对照组正常肝胰腺蛋白质组表达图谱. 分别识别出203和107个蛋白质点. 筛选并尝试鉴定数个差异蛋白. 对各方法步骤进行了技术探讨，对实验过程提出了一系列建议. 建立了双向电泳及生物质谱方法研究中国对虾白斑病的蛋白质组学技术体系. 该体系拓宽了对虾免疫生理研究的途径，以从蛋白质水平探讨对虾发病机制，寻找有效药物靶点.     

新基因Splt137在大肠杆菌中的表达及抗体制备

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒 (SpltMNPV)ORF137全长基因 (Splt137)。将其克隆到原核表达载体pQE30上 ,并转化大肠杆菌M15 ,在IPTG诱导下表达了与预期相对分子质量相符的一个 2 7× 10 7的蛋白质 ,经过聚丙烯酰氨凝胶电泳纯化 ,免疫家兔制备了抗Splt137抗体。Western免疫印迹分析表明 ,该抗体适合用作Splt137蛋白的进一步分析。     

酿酒酵母金属硫蛋白的表达、纯化及活性检测

通过PCR从酿酒酵母基因组DNA上扩增得到酿酒酵母基因CUP1编码的金属硫蛋白序列.将其编码序列克隆到质粒pTWIN1构建重组表达质粒pTWIN1-MT,转化大肠杆菌感受态细胞ER2566.重组融合蛋白CBD-intein1-MT在IPTG的诱导下得到表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定.用重组菌分别进行铜离子耐受...