锌指结构域序列的进化生成模拟——遗传算法在蛋白质结构研究中的应用

<正> 遗传算法(Genetic algorithms, GA)是具有高频率的搜索机制的算法.遗传算法不仅为蛋白质结构研究提供了一种全局自适应搜索算法,使能量最低状态(按热力学假说,蛋白质的天然状态的能量最低)的搜索更加方便,而且为我们提供了一种新的想法和研究思路.通过应用遗传算法对锌指结构域序列进行进化模拟,成功地从随机产生的氨基酸序列中,进化生成了一些潜在的锌指结构域序列,不仅在一定意义上证明了氨基酸序列起源的随机性,而且对遗传算法在大规模解空间的搜索能力进行了测试.     

与对称性相关的蛋白质序列-结构关系

蛋白质的氨基酸序列如何编码它的三级结构是一个极具挑战性的问题[1~3].虽然蛋白质的氨基酸序列看起来非常不规则,但它编码的三级结构表现出明显的规则性.例如,许多蛋白质具有对称的三级结构,但它们的氨基酸序列看起来象随机序列.因此人们对蛋白质序列关联性进行了大量的研究[4~8],希望确定蛋白质序列是否是随机的.然而,这些研究给出了相反的结果,一些研究表明蛋白质序列与随机序列不可分,而另外一些研究认为蛋白质序列不是随机的.本文将研究3种小的α类蛋白质结构域.这些是具有对称三级结构的最简单的蛋白质结构域.我们将说明这些结构域的…     

SARS-CoV蛋白质组的生物信息学及其进化关系

一种新的冠状病毒 SARS-CoV是引起严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)的病原体. 对由SARS病毒全基因组序列推导出的所有蛋白质逐一进行分子量、等电点、分子消光系数等物理化学性质计算, 以及跨膜区和亚细胞定位预测, 辅以保守序列家族数据库搜索, 预测SARS-CoV功能未知蛋白质的功能. 同时, 通过SARS-CoV与其他冠状病毒蛋白质同源序列比较和进化距离计算, 分析SARS病毒的分类地位以及与其他冠状病毒的进化关系. 结果表明, 尽管SARS病毒是不同于其他3组冠状病毒的一种全新冠状病毒, 但在进化关系上更靠近牛冠状病毒BoCoV和鼠肝炎病毒MHV. 为实验测定SARS病毒蛋白质组以及抗SARS疫苗研制提供了参考和帮助.     

13个水稻WRKY基因的克隆及其表达谱分析

转录调控因子WRKY蛋白拥有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和Cys₂His₂或Cys₂HisCys锌指型结构. 利用WRKY蛋白质的保守结构域, 搜索了整个水稻基因组编码WRKY蛋白质的基因, 鉴定了97个WRKY基因, 并从4℃胁迫的水稻植株cDNA文库中获得13个WRKY基因全长cDNA克隆. Northern blotting分析结果显示, 其中10个WRKY基因的表达受到NaCl, PEG, 低温(4℃)和高温(42℃)等4种非生物逆境因子胁迫的影响, 但其诱导表达模式不论在逆境因子种类还是在诱导时间上均存在着很大的差异, 这种基因诱导表达模式的差异可能体现于它们之间的生物学功能的差异.     

锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶

该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.     

人类C2H2型锌指蛋白基因ZNF199全长cDNA的分离与克隆

锌指蛋白是一类参与基因表达调控的重要调节蛋白,这些蛋白可与ＤＮＡ/ＲＮＡ相互作用,从而参与基因的表达调控.迄今已克隆的人类锌指蛋白基因近200个.根据保守结构域的差异,锌指蛋白可分为数种类型,其中Ｃ2Ｈ2型锌指蛋白占绝大多数,这种蛋白质的锌指基序由28个氨基酸组成,常为ＹＥＣＸ2ＣＸ3ＦＸ5ＬＸ2ＨＸ3ＨＴＧＥＫＰ,其序列是非常保守的,特别是各个锌指之间的毗邻区(ＴＧＥＫＰ)极其保守[1].近期研究表明,锌指蛋白基因结构的变异与肿瘤发生、胚胎发育和分化等密切相关,如人体锌指基因ＷＴ1和ＬＡＺ3的易位可分别导致Ｗｉｌｍ’ｓ瘤[2]和…     

SARS相关病毒与鼠肝炎病毒S蛋白的同源暗示一个潜在受体结合区的存在

最近, 一种新的冠状病毒被确定为近期爆发的严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体. 虽然人们对人冠状病毒229E已经有了较多的研究, 而且其受体结合位点也被确定在S蛋白第417~547个氨基酸残基之间. 但是, 这一区域与新分离的SARS相关病毒(香港株, CUHK-W1)没有任何同源性. 有意思的是, 已知的各种冠状病毒S蛋白S1亚基的序列比对和进化分析显示, 鼠肝炎病毒(MHV)与SARS相关病毒的同源性最高. 而且, MHV的S蛋白上负责受体结合的重要位点(第62~65和第214~216位氨基酸残基)与SARS相关病毒的相应区域(第51~54和第195~197位氨基酸残基)高度同源. 这些生物信息学的分析结果可能对研究SARS相关病毒的受体结合位点和病毒侵染靶细胞的机理有所帮助, 进而为设计抗病毒药物和疫苗提供新靶点.     

Chk1 C 末端调控结构域对其在DNA 损伤后的核定位及修复活性的影响

DNA 损伤效应激酶Chk1 是一种在进化过程中高度保守的蛋白激酶, 它是联系DNA 完整监控器和细胞周期引擎的关键介导蛋白. 通过对一系列GFP 标记的Chk1 调控结构域缺失突变体细胞核定位变化分析, 发现Chk1 C 末端调控结构域中的34 个氨基酸残基(334~368)参与了调控损伤诱导的Chk1 核积累. 同时通过构建Chk1 及不同Chk1 调控结构域缺失突变体的pXJ41 重组质粒, 并与报告质粒pEGFP-N2 共转染HeLa 细胞, 研究不同Chk1 调控结构域缺失突变体的DNA 损伤修复能力, 同时检测了不同Chk1 调控结构域缺失突变体对细胞周期的影响, 并通过Western blot 检测Chk1 下游靶标Cdc25C 的磷酸化情况进行了Chk1 缺失突变体激酶活性分析. 结果显示, C 末端缺失108 个氨基酸残基(368~476)的CΔ368 活性高于全长Chk1,并且其过表达可诱导细胞G1/S 期阻滞, 延迟细胞周期进程. C 末端缺失142 个氨基酸残基(334~476)的CΔ334 活性与全长Chk1 相当, C 末端缺失188 个氨基酸残基(288~476)的CΔ288几乎没有酶活性, 说明调控结构域包括抑制和激活元件. 通过本研究对Chk1 的功能有了新的更为深入的认识.     

SARS相关病毒(BJ01株)的全序列及其比较分析

严重急性呼吸综合征(SARS)是一种新发现的急性传染病. 对一株已确认为SARS病原体的冠状病毒(BJ01)进行了全基因组序列测定, 并与其他已知病毒进行了比较分析. 该病毒基因组全长为29.725 kb, 含11个可读框(ORFs), 由1个稳定区和1个可变区组成, 其中稳定区编码RNA依赖性RNA聚合酶, 包括两个ORFs；可变区含有4个蛋白质编码序列(CDSs), 分别编码病毒的4个结构蛋白(S, E, M, N蛋白). 此外, 可变区还包括5个非典型的预测蛋白(PUPs). 此病毒基因的排列顺序与其他已知的冠状病毒一致. 通过与已知RNA病毒的序列比对, 可以确认该病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae). 与GenBank中已知的5个SARS相关病毒全基因组序列的比较分析显示, 已在30个核苷酸位置上检出序列差异, 总体突变率为0.1%, 其中15个变异位点在编码区, 可能会导致蛋白质的氨基酸改变(异义突变). S蛋白中已发现3处可能引起该蛋白质物化特征变化的变异, 而该蛋白质可能参与病毒与宿主间的免疫反应. 与病毒包膜形成相关的M蛋白中则已发现两处氨基酸变化. 进化分析表明, SARS病毒可能不是来源于人类, 但没有证据证明是人为制造的. 为了阐明SARS相关病毒的病因学以及排除其他可能的SARS病原体的存在, 仍需进行更深入的研究.     

从基于结构定义的序列模体识别蛋白质的超家族

以进化上相距较远的蛋白质酪氨酸磷酸酶Ⅰ和Ⅱ为例, 通过结构比较和基于结构的序列比对及共同保守区域残基替换模式的分析, 定义了基于结构的序列模体. 利用这种新的模体对SWISS-PROT和TrEMBL蛋白质序列库进行搜索, 可特异性地同时识别磷酸酶Ⅰ和Ⅱ, 其识别正确率可达98.4%. 而在此之前, 尚未见可同时识别磷酸酶Ⅰ和Ⅱ序列模体的报道.     

分子进化的速率问题

生物在其漫长的进化过程中,不仅从低级向高级进化,而且伴随着分子进化。生物界虽然千姿百态,但其基本构成都是蛋白质和核酸。经过研究,发现亲缘关系越近的生物,氨基酸差异数越小,反之则越大。这种蛋白质分子差异为揭示生物进化提供了有力的佐证。《分子进化的速率问题》一文或许对此感兴趣的读者有所裨益。     

大鼠乳酸脱氢酶辅酶结合结构域的克隆与表达

为了研究分离结构域的结构与功能关系 ,利用聚合酶链式反应 (PCR)方法分离出大鼠肌肉乳酸脱氢酶的N端编码1～163位氨基酸的辅酶结合结构域的基因片段 .此结构域分别在热诱导表达系统和融合表达系统中获得高效表达 ,两系统获得的单独结构域经N端序列分析表明表达正确 .有关辅酶结合结构域工作正在进行.     

大鼠乳酸脱氢酶辅酶结合结构域的克隆与表达

为了研究分离结构域的结构与功能关系 ,利用聚合酶链式反应 (PCR)方法分离出大鼠肌肉乳酸脱氢酶的N端编码 1～ 16 3位氨基酸的辅酶结合结构域的基因片段 .此结构域分别在热诱导表达系统和融合表达系统中获得高效表达 ,两系统获得的单独结构域经N端序列分析表明表达正确 .有关辅酶结合结构域工作正在进行 .     

一种基于结构域的蛋白质功能分类预测新方法

从已知的蛋白质序列数据出发，预测蛋白质的功能是生物信息学研究的一项重要任务。常见而有效的一种方法是将蛋白质按照其序列特征归并到不同的功能类中去。据此我们应用最大似然估计（MLE）算法，发展了一种以蛋白质结构域组成特征为基础的方法，对蛋白质进行功能分类。我们对酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组用MLE方法和文献中记载的另一种方法进行了预测，并对两种方法进行了比较。结果表明MLE方法预测明显优于文献中记载的另一种方法。MLE方法的特异性达到75.45%，敏感性达到40.26%。这个结果也说明结构域是蛋白质的一个重要特性，它与蛋白质的功能紧密相关。     

新疆细羊毛辐射效应的NMR研究

羊毛纤维主要是由α角蛋白组成的天然大分子纤维,含有较全的一般氨基酸.由于多肽链结构中富含许多二硫交联键的胱氨酸,因此难以溶解.多年来对羊毛蛋白质一级结构的研究一般需要对其进行化学降解和提纯后方可进行分析.这不但费工费时而且还破坏了羊毛纤维的聚集态结构和α螺旋结构.近年发展起来的固体高分辨NMR方法,则无需对试样进行溶解和破坏即可直接测试.这不但可方便省时地进行蛋白质序列结构的分析,而且可以提供一些有关蛋白质二级结构信息,因而引起了人们极大的兴趣.Asakura等曾用固体NMR方法对蚕丝蛋白进行了系列的研究,取得了很大的进展.我们用固体~(13)C CPMAS方法,对新疆细羊毛纤维角蛋白在~(60)Coγ射线辐照下的稳定性以及羊毛-丙烯腈,羊毛-丙烯酸辐射接枝共聚物的结构进行了初步的研究.     

水稻花优势表达基因RA68的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻花中克隆了1个编码含丰富脯氨酸和苏氨酸结构域多肽的cDNA, 其相应的基因命名为RA68. RA68含3个外显子和2个内含子, 编码由219个氨基酸残基组成的蛋白质. 数据分析结果显示, 该蛋白由1个22个氨基酸残基组成的信号肽, 1个亲水性的N-端结构域和1个疏水性的C-端结构域组成. N-端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列. Southern blot和序列分析结果表明, RA68在水稻基因组以单拷贝存在, 定位于第2号染色体. Northern杂交结果表明, RA68在幼芽和花中表达量较高, 在根和叶中不表达. 花和幼芽进行原位杂交分析结果表明, 在花中, RA68在花粉母细胞、二分体细胞、单核花粉粒以及大孢子囊中表达. 基于该基因的表达特性及其编码蛋白质的结构特征, 探讨了其在花发育中的可能功能.     

拟南芥动蛋白基因AtKP1的克隆、表达及生物化学特性分析

动蛋白(kinesin)种类很多, 在真核细胞中行使多种功能. 利用3′-RACE 技术从拟南芥中克隆了动蛋白-14B 亚家族中的一个成员, 命名为AtKP1 (拟南芥动蛋白1). 其最大可读框为3.3 kb, 编码1087个氨基酸. 结构域分析表明,AtKP1多肽链中部有一个马达结构域, 氨基端有一个CH结构域, 羧基端一个含有202个氨基酸残基的序列表现出很强的特异性. Northern印迹表明, AtKP1基因在各种器官中广泛表达, 但在幼苗中表达量最大. 将克隆的长度为2808 bp的AtKP1启动子区域与GUS 基因进行了融合, 转基因分析显示, AtKP1主要在幼嫩器官维管束和幼叶表皮毛中表达, 表明AtKP1可能参与了维管束和叶表皮毛的分化或发育. 对AtKP1的马达结构域进行了原核表达和亲和纯化, 生物化学特性研究表明这个马达结构域可以核苷酸依赖的方式与微管结合, 且具有微管激活的ATP酶活性.     

锌指蛋白ZNF191(243-368)的拉曼光谱

采用拉曼光谱技术研究了锌指蛋白ZNF191锌指区蛋白ZNF191(243-368)在野生型状态及热变性、EDTA变性条件下的结构及其变化. 结果表明, ZNF191(243-368)中Zn²⁺ 离子与His/Cys的配位是维持锌指结构的重要因素, 它对于维持锌指结构单元中的疏水核及二级结构均起到重要作用. 拉曼光谱是考察ZNF191(243-368) 结构的一种有力手段.     

哺乳动物驱动蛋白的计算基因组学分析与鉴定

提供了一种新颖的、基于比较基因组学方法的全长驱动蛋白预测方法(full-length kinesin prediction program, FKPP), 用于哺乳动物中驱动蛋白质组的鉴定与研究. 之前的预测认为, 哺乳动物共含94个驱动蛋白, 而用FKPP从哺乳动物的基因组中总共鉴定出134个可能的驱动蛋白基因. 基于数据库中存在的片段序列, 用FKPP鉴定出25个可能的全长驱动蛋白. 此外, 用FKPP方法发现人的动点马达蛋白CENP-E应包含2701个氨基酸, 而不是当初根据克隆预测的2663个氨基酸. 通过对CENP-E的cDNA进行重测序, 并同时采用特异性识别FKPP预测的CENP-E多肽抗体予以实验评估, 结果表明, FKPP预测的CENP-E氨基酸序列是正确的. 为此, 本研究利用FKPP对哺乳动物的驱动蛋白进行了重新分类. 鉴于目前公共数据库含有较多非全长序列的蛋白片段, FKPP可提供一个具有显著效率且准确新颖的全长序列预测手段, 用于驱动蛋白以及其他蛋白家族的分子鉴定.     

蛋白激酶研究进展

蛋白激酶的研究不仅有理论意义,而且有重要的现实意义.因为蛋白质磷酸化和去磷酸化(即“可逆蛋白质磷酸化”)是所有具有重要生物学功能的磷蛋白(千种以上)活性、性质改变的“开关”,因此,可以通过用人工方法对功能蛋白(酶)磷酸化和去磷酸化的化学修饰和去修饰来调节细胞代谢、生长、分化、增殖,这一方法在农业、医药、食品和化学工业等方面有广泛的应用价值.值得指出的是,中科院院士、清华大学教授赵玉芬已经合成了几十种具有催化功能的磷酰氨基酸,并提出了“微型酶”学说.众所周知,氨基酸本身化学性质十分稳定,无催化活性,当它与磷酸作用合成磷酰氨基酸时变得极其活泼,具有催化剂的功能,为模拟酶的研究和合成开辟了一个崭新的途径和领域.可以设想,以氨基酸为基本组成单位的生物大分子蛋白质或多肽通过磷酸化和去磷酸化的修饰和去修饰必将使蛋白质或多肽具有许多新的化学性质和功能,为模拟酶、酶工程、蛋白质化学工程的研究和应用开辟新的途径,具有广泛的发展前景.