蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

αB-晶状体蛋白CRYAB基因重组表达载体的构建及分子生物学鉴定

目的:构建人晶状体蛋白CRYAB基因与真核表达载体pIRES2-DsRed-Express的重组体,为研究人晶状体蛋白CRYAB基因的功能奠定基础.方法:根据人晶状体蛋白CRYAB基因的核苷酸序列,设计并合成分别带有酶切位点的引物,从pMD 18T-CRYAB基因克隆载体中扩增出CRYAB基因外显子片段,与载体pIRES2-DsRed-Express连接构建人晶状体蛋白CRYAB基因的表达载体,转化入大肠杆菌DH5α中.经抗生素筛选阳性克隆,通过酶切图谱分析、菌落PCR和测序鉴定所构建的表达载体.结果:构建的载体经PCR、酶切鉴定和测序证实插入方向正确,表达阅读框正确,载体构建成功.结论:重组人晶状体蛋白CRYAB基因表达载体的构建为研究CRYAB基因的功能及进一步研究先天性白内障的发病机制奠定了基础.     

克氏原螯虾主要变应原原肌球蛋白的一个片段区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

克隆克氏原螯虾主要过敏原原肌球蛋白的一个片段区基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫原性.提取克氏原螯虾总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆得到目的基因;将目的基因连入pMD19-T载体,提质粒酶切鉴定并测序;将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;利用Western-blotting和ELISA检测该重组蛋白的免疫原性.克隆获得目的基因,其片段长为291 bp,编码97个氨基酸.重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western-blotting和ELISA结果表明该蛋白与克氏原螯虾过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性.     

EGFP和ALR融合基因表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

从人血液中提取总DNA，利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因，将其插入表达载体pEGFP—C1的多克隆位点中，构建增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein gene，EGFP）和人肝细胞再生增强因子（human augmenter of liver regeneration gene，ALR）融合基因表达载体pEGFP／ALR，并将其转染Hela细胞系，用含G418的DMEM／F12培养液筛选转基因细胞，然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达，用荧光显微镜检测EGFP基因的表达．结果显示：得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体；在转基因细胞中，PCR扩增得到1．7Kb的ALR条带，蛋白电泳得到57KD大小条带．与ALR和EGFP融合蛋白大小相符；荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞．在转基因细胞中，EGFP和ALR同时存在并表达，绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达，从而简化了目的基因繁琐的检测手段．     

高山离子芥CbPLDβ基因对转基因烟草抗寒性的影响

为分析高山离子芥CbPLDβ基因的抗寒性价值,本实验构建了高山离子芥CbPLDβ的表达载体PBI121-CbPLDβ并转化烟草,经过筛选及PCR测序鉴定,获得转基因烟草植株.通过低温胁迫实验,分析了转基因烟草的抗寒性,结果表明:外源基因已经整合到烟草基因组中,在低温胁迫下转基因烟草植株的电解质渗透率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均高于野生型烟草,说明CbPLDβ基因提高了烟草抵抗低温的能力.     

花生过敏原Ara h2.02的克隆、表达及免疫学鉴定

通过提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h2.02基因,将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序,将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中,IPTG诱导表达、Western-blotting检测该重组蛋白的免疫原性.测序结果表明:克隆的花生Ara h2.02基因片段全长为519 bp,编码为172个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同.诱导表达后的蛋白经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western-blotting结果表明该蛋白能与花生过敏病人混合血清中的IgE结合,具有免疫原性.成功克隆并表达了花生过敏原Ara h2.02,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性.     

乙型肝炎病毒x基因蛋白转导载体的构建

乙型肝炎病毒X蛋白在细胞转化和肝癌的发生发展中具有重要作用.为了深入研究X蛋白的致癌机理构建了pTAT-GFP-X载体.该研究以克隆在真核表达载体pCMV-X质粒中的x基因为模板,设计了x基因的PCR引物,采用PCR方法扩增x基因,回收PCR产物,以XhoI和EcoRI酶切位点将PCR产物连接到蛋白转导系统pTAT-GFP载体中,再用XhoI和EcoRI酶对筛选的重组子进行酶切鉴定,获得了510bp的目的片段,表明已成功地将目的片段克隆在pTAT-GFP载体中.经DNA序列分析检测,显示克隆的x基因无突变.经SDS-PAGE和Westernblot检测证实,将重组质料pTAT-GFP-X转化致大肠杆菌BL21中,可表达pTAT-GFP-X融合蛋白.该pTAT-GFP-X载体蛋白转导系统的构建,为进行X蛋白的蛋白转导实验奠定了基础.pTAT-GFP-X融合蛋白具有穿透细胞膜进入细胞的能力,进而在细胞内发挥作用,与转基因不同,无需细胞内基因表达的过程,使得X蛋白的定量实验成为可能,X蛋白的蛋白转导实验更有助于探讨x基因的致癌机理.     

重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因工程菌的构建与表达

人心肌肌钙蛋白Ⅰ(hcTnI)是临床检测心肌损伤及预后提供诊断的生物学指标,由于来源有限,采用基因重组技术,以期获得高表达量的人心肌肌钙蛋白Ⅰ.人工合成hcTnI基因,将其插入pET-11a载体中,通过酶切鉴定正确后转入表达宿主菌BL21(DE3)中,诱导表达目的蛋白.采用蛋白免疫印迹反应(Western Blot,WB)鉴定表达目的蛋白的免疫特异性.经SDS-PAGE证实重组蛋白的相对分子质量约为2.6×104,凝胶密度扫描软件检测到目的蛋白占总蛋白比例为30.1%,WB实验验证诱导后目的蛋白特异性良好.成功构建了重组hcTnI基因在大肠杆菌表达的工程菌株,并获得表达,为制备高特异性的抗体及临床检测应用和测定标准化奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv2626c基因的表达、纯化和鉴定

克隆结核分枝杆菌Rv2626c基因,构建其原核表达载体,并进行表达、纯化及鉴定.采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv2626c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,转化入E.Coli DH5α,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后与抗His单抗进行Western-blot,以Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.PCR扩增获得的目的基因为432bp,与预期大小一致,测序与Genebank公布的基因序列完全一致.成功构建原核表达载体pPro-EXHTb-2626c,转化E.Coli DH5α后能特异性表达目的蛋白,大小约16KD,与理论值相一致.蛋白可溶性分析表明该蛋白主要以可溶性方式存在,纯化蛋白经Western-blot鉴定有特异性反应条带.成功构建结核分枝杆菌Rv2626c原核表达载体pPro-EXHTb-2626c,并获得纯化的目的蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础.     

疏水蛋白HGFI用于载基因组织工程支架的研究

以具有两亲性的疏水蛋白HGFI为基础,通过正负电荷的相互作用将质粒与PEI的复合体固定在了修饰有疏水蛋白HGFI的PCL支架材料上.对不同时间段释放的质粒进行了定量测量并绘制曲线,结果表明载基因支架上的基因有四分之三左右在固定的12 h内释放.用载基因支架进行体外293T的转染实验,载基因支架的转染效率为21.76%.该转染效率与直接用转基因试剂对贴壁细胞转染的效率低很多,但对于组织工程支架来说,已具有一定的基因递送功能.大鼠皮下埋植实验表明,在体内埋植3 d后,载基因支架有着良好的体内转染效果,对体内的转基因阳性细胞进行初步检测发现,支架埋植初期有大部分被转染细胞为巨噬细胞,而对巨噬细胞进行转染是否对组织修复有益还需进一步的研究.大鼠皮下埋植2 w后,对埋植的材料进行血管化的检测,组织切片进行vWF免疫荧光染色和成像,成像结果说明载基因支架显著地促进了支架材料在体内的血管新生,推测支架上固定的质粒在体内转染后表达出了目的蛋白e NOS,从而促进了支架材料周围组织的血管化.本实验中,载基因支架的转染效率还需进一步提高,体内转基因阳性细胞的种类还需进行进一步鉴定,功能蛋白eNOS的表达和检测还需要进一步的研究.     

蛋白质工程的研究进展及前景展望

简介了蛋白质工程的由来和实施工程的目标,论述了蛋白质工程取得的若干研究进展,并展望了其未来发展趋势。     

SCP-2基因的表达调控研究进展

固醇转运蛋白(SCP-2)是广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中的非特异性脂转运蛋白.任何影响固醇转运蛋白基因表达的因素都会影响甾类激素的合成,进而影响生物体的发育.目前对该基因的转录调控研究较少,主要集中在哺乳动物.环境、激素、转录因子等对SCP-2基因的表达调控均有影响,对SCP-2基因作为害虫防治靶标的可能性进行了初步的探讨.C/EBP蛋白作为调控Sl SCPx基因表达的转录因子,可以调控Sl SCPx基因的表达.推测了C/EBP蛋白成为新的害虫防治的靶标的可能.     

RNAi技术研究进展

RNAi是由双链RNA引起的基因沉默现象，它通过降解具有同源序列的mRNA起作用，特殊设计的siRNA能使目的基因发生特异性沉默．目前，获得siRNA已经非常方便，导入方式最常用的是微注射．RNAi技术有编码区RNAi和启动子区RNAi两大类，均可以产生类似基因敲除的功能。在家蚕功能基因的研究中已经使用了这种方法．随着RNAi技术的不断进步，RNAi可广泛地应用到功能基因组学，药物靶点筛选，疾病治疗等方面．     

研究生分子生物学综合实验设计──IMPACT蛋白单柱亲和纯化

设计了一个研究生分子生物学综合实验,利用内含肽介导的IMPACT系统对蛋白质进行纯化。将目的基因构建入pTWIN2载体,转化至大肠杆菌ER 2566中诱导其表达,进化亲和层析,检测其表达情况。该方法具备比以往亲和层析纯化方法更加经济的特点,可提高目的蛋白表达的成功率。通过本实验使学生掌握的分子生物学研究中最新的蛋白质分离纯化操作技术,为进一步学习和掌握复杂、综合性的分子生物学技术打下扎实的基础。     

蜂毒素-SP94杂合基因原核表达载体的构建及蛋白纯化

用可以特异结合到肝癌细胞膜上的小肽SP94,与蜂毒素连接,构建重组表达载体pET32a-蜂毒素-SP94.转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达结果,产物经Ni-NTA Agrosc亲和层析柱纯化后进行Tricine-SDS-PAGE检测.重组蛋白在大肠杆菌中高效表达,约占细胞总蛋白...     

LEA基因及Lea蛋白的研究进展

综述了有关ＬＥＡ基因及Ｌｅａ蛋白的研究进展：ＬＥＡ基因与Ｌｅａ蛋白的结构和功能;ＬＥＡ基因表达和Ｌｅａ蛋白积累与环境胁迫的关系;一种ＬＥＡ基因即ＨＶＡ１基因及其转基因研究     

在Hep G2细胞中利用siRNA沉默GFP基因的实验探讨

目的:通过探讨小分子双链RNA(siRNA)通过RNA干扰(RNAi)机制沉默肝癌细胞株Hep G2荧光素报告基因GFP的各项生物学指标,为进一步实验和临床研究提供依据.方法:通过体外实验,对siRNA和siRNA脂质体的稳定性和细胞毒性进行评估;通过荧光标记技术,研究不同时间siRNA脂质体的转染效率;通过荧光显微镜下观察转染细胞和RT-PCR检测靶基因mRNA表达,确定不同种类、形式、剂量的siRNA对靶基因的沉默效能.结果:在空白培养液中,siRNA和siRNA脂质体可稳定至4h,在5%血清中2～4h后明显降解;100nM的siRNA和siRNA脂质体无明显细胞毒性;siRNA脂质体转染细胞株的效率随时间不同而不同,4h可达90%;非特异性siRNA/脂质体无沉默靶基因表达作用,特异性siRNA/脂质体对靶基因的沉默作用在一定范围内随剂量升高(20nM、50nM、100nM)而升高.结论:siRNA的稳定性可满足实验需要,且无明显细胞毒性,特异性siRNA转染肝癌细胞株能有效抑制靶基因表达,用脂质体转染可提高转染效率.siRNA通过RNAi机制沉默靶基因表达,为肿瘤的治疗和基础研究提供了新的工具和思路.     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

Analysis of the p42.3 protein structure and regulatory network

p42.3 is a recently discovered gene that may participate in the regulation of gastric cancer cell generation and development. In this research, we analyzed the predicted p42.3 protein structure using bioinformatics tools, established the regulatory network of the protein molecule and found the optimal pathway using a Bayesian network model.     

GPCR高度保守位点与二聚化功能

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是具有7个跨膜螺旋的蛋白受体,根据其序列的相似性以及与配基的结合情况,共分为五个亚家族,是人体内最大的蛋白质家族,也是重要的药物靶标.它的结构与功能的研究对于新药的开发、研制以及推动医药领域的发展起着举足轻重的作用.