产中性蛋白酶能力影响蜡样芽孢杆菌0-9在绿豆根际的定殖

以生防细菌蜡样芽孢杆菌(Bacillus creus)0-9菌株为试材,利用同源重组方法敲除中性蛋白酶编码基因nprB,构建基因缺失突变体ΔnprB,测定了野生型0-9及其突变体ΔnprB的胞外蛋白酶产生能力和对立枯丝核菌(Rhizoctonia soloni)的拮抗能力.结果显示,相对于野生型菌株0-9,ΔnprB产胞外蛋白酶能力下降,但对立枯丝核菌的拮抗能力没有改变.盆栽实验测定两种菌株在绿豆根际的定殖能力和对绿豆立枯病的防治效果,结果显示,突变体ΔnprB的定殖和生防能力均低于0-9菌株.上述结果表明,蜡样芽孢杆菌0-9能够通过中性蛋白酶的作用促进其在绿豆根部的定殖借以持续发挥生防效果.     

益生素生产菌的生物学特性研究

从土壤分离到三株杆菌,经鉴定为蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌,杆菌有８水解淀粉的能力,并能利用葡萄糖产酸;在ＰＨ值２．２－７．０范围内有较高的存活率,能抵抗多种抗生素,是较为优良的益生素生产菌。     

贝莱斯芽孢杆菌3A3-15生防和促生机制

为揭示贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)3A3-15生防和促生作用相关机理,采用9对特异性引物对其抑菌基因和促生长基因进行PCR检测,并分别通过Sackowski法、Schwyn和Neiland法检测其分泌吲哚乙酸(IAA)和嗜铁素能力,通过高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS)分析其发酵液抑菌成分,采用平板对峙实验和孢子萌发抑制实验分析该菌株的抑菌机理.结果表明,贝莱斯芽孢杆菌3A3-15中的抑菌基因包括yndJ、srfAB、ituC、bamC和fenD,促生长基因包括ysnE和dhbC.该菌株分泌嗜铁素能力较强,A_s/A_r值达到0.238,鉴定其抑菌物质为C14～C15 surfactinA,且贝莱斯芽孢杆菌3A3-15的次生代谢物能导致病原菌(尖孢镰刀菌)菌丝扭曲、膨大、畸形,对其孢子萌发抑制作用较强,抑制率达93.2%.以上结果说明贝莱斯芽孢杆菌3A3-15具有较好的生防和促生潜力,是防治尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病的潜在菌株.     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株防治松材线虫病研究

【目的】松材线虫病是一种由松材线虫对赤松、马尾松、黑松等易感树种寄生取食继而引起树种死亡的病害,其发病速度快、易传播,传统的物理、化学防治成本高,且化学防治对环境易造成不可逆的污染,目前还没有较好的防治方法。为寻找安全有效的生物防治方法,笔者探究蜡样芽孢杆菌在温室下对马尾松盆栽苗松材线虫病的防治效果。【方法】采用人工皮接法将2 000、4 000和6 000条松材线虫AMA3虫株分别接种到2年生马尾松幼苗上,测定发生松材线虫病症状的临界值;蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株是从南京湿地松上分离出的具有杀线虫作用的松树内生细菌,在接种松材线虫AMA3虫株的前7天、当天和接种后第7天用灌根法灌入蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液,并设置对照试验:将发酵液、菌悬液和发酵滤液稀释10倍后,各取20 mL灌注到2年生马尾松根部,其中发酵液和菌悬液的菌体浓度为4×10⁸ cfu/mL,以无菌水和培养基处理为对照,比较蜡样芽孢杆菌不同发酵产物对松材线虫病的防治效果;以灌根法分别施入20 mL菌体浓度为4×10⁸、4×10⁷、2×10⁷ cfu/mL的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液;将蜡样芽孢杆菌以菌粉水悬液灌根法和菌粉涂抹法两种方式处理2年生马尾松幼苗。从施菌浓度、施菌方法和施菌时间等3个方面对经过低温喷雾干燥制备的蜡样芽孢杆菌菌粉进行防治松材线虫病试验,观察各处理下马尾松的发病情况。【结果】2年生马尾松接种松材线虫AMA3虫株后发病的临界值为4 000条。采用灌根法施入蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的发酵液和无菌发酵滤液后不能对松材线虫病起到预防作用,施蜡样芽孢杆菌菌悬液对松材线虫病有一定的预防效果(33%)。蜡样芽孢杆菌对马尾松松材线虫病的预防效果要大于治疗效果,健康马尾松在接种线虫之前以灌根法施入蜡样芽孢杆菌的预防效果会更好。将蜡样芽孢杆菌菌粉直接涂抹松枝,与菌粉水悬液灌根的方法相比,两者对松材线虫病的防治效果相当。同一菌体浓度下蜡样芽孢杆菌菌粉水悬液和发酵菌悬液对松材线虫病的预防效果相当;施用蜡样芽孢杆菌菌粉水悬液对松材线虫病的防治效果随菌体浓度的增加有所提高,当菌体浓度达到一定值以后,增加浓度也不会提高防治效果。【结论】在蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株防治2年生马尾松幼苗松材线虫病前,先筛选2年生马尾松接种松材线虫的临界值,能有效避免因接种松材线虫浓度过大而使真实防治效果降低的缺点。蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌悬液和经低温喷雾干燥制得的菌粉对松材线虫病均有一定的预防效果,在马尾松未感染松材线虫的健康状态施用蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株效果更好,通过菌粉涂抹法处理松枝可以对松材线虫病产生预防效果。     

土木香内生细菌的分离鉴定及抑菌活性检测

利用组织分离法从用药植物土木香根、茎和叶中分离得到内生细菌32株.采用纸片法对菌株进行了抑菌活性研究,并运用生理生化与分子生物学方法进行种类鉴定.抑菌试验结果表明,10株内生菌发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及禽多杀性巴氏杆菌均有不同程度的抑菌活性.鉴定结果表明,菌株YIR-5,YIR-7,YIR-8,YIR-9为假单胞菌属菌种,菌株YIR-3,YIR-6为沙雷氏菌,菌株YIR-4,YIS-1,YIS-2分别为水生拉恩氏菌、薄壁芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌,而菌株YIL-3归属于芽孢杆菌属.土木香内生细菌组成丰富,莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）YIS-1对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和禽多杀性巴氏杆菌的抑菌活性最强.     

一株产脂肪酶蜡状芽孢杆菌的分离鉴定

从三角湖生活用水排污口取样,利用橄榄油培养基筛选产脂肪酶菌株。革兰染色结果为革兰氏阳性杆状菌;16SrDNA序列显示,该菌为蜡状芽孢杆菌;并从生理生化特征上进一步证实了是蜡状芽孢杆菌;对其生长曲线进行了测定;其生长规律与模式菌株大肠杆菌基本相同。对蜡状芽孢杆菌脂肪酶分解不同类型油脂的能力进行了评估,该菌脂肪酶对猪油分解能力强,橄榄油及花生油次之,对牛油分解能力差。     

黔产生黄精多糖的抑菌活性研究

目的:探究贵州生黄精多糖的体外抑菌作用.方法:采用石油醚脱脂后超声提取再纯化得到黄精多糖,以白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌为抑菌试验对象,通过纸片法,探究黔产生黄精多糖对这五种菌的抑菌效果.结果:实验表明黔产生黄精多糖对五种供试菌株均有明显的抑菌作用,抑菌效果:巨大芽孢杆菌＞解淀...     

一株拮抗细菌所产抑菌物质的特性分析及初步鉴定

为考察一株拮抗细菌所产拮抗物质的性能及初步判断拮抗物质的类型,通过测定抑菌圈大小、硫酸铵分级沉淀、低温乙醇沉淀及茚三酮反应、双羧脲反应、莫氏实验及糖还原实验对拮抗物质特性及类型进行分析判断.结果表明,该拮抗细菌所产拮抗物质具有较好的广谱抗菌性,对炭疽杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌有较强的抑菌作用.经一系列化学反应检测,初步推断该菌株所产拮抗物质为一种糖蛋白质类物质.利用该菌株所产抑菌物质的广谱性和稳定性,进行植物病虫害防治将具有诱人的开发应用前景.     

产β-葡萄糖苷酶芽孢杆菌的筛选及水解大豆异黄酮糖苷研究

为获得能高效水解大豆异黄酮糖苷的芽孢杆菌,利用七叶苷平板分离法从动物的新鲜粪便中筛选产β-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌菌株,然后对酶活最高的菌株进行种属鉴定和水解大豆异黄酮糖苷的研究.结果显示:筛选到1株酶活力较高的芽孢杆菌R2-2,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);该菌株有较高的糖苷水解能力,黄豆苷水解率最高达到53.65%,染料木苷为48.80%.     

16S rDNA与gyrB序列联合法鉴定一株蜡样芽孢杆菌

以从凝结芽孢杆菌活菌片中分离得到的一株YSSNJ-005菌株为目的菌株,经16S r DNA与gyr B序列联合法对其精确鉴定。研究结果表明:经过16S r DNA序列分析,初步判定菌株YSSNJ-005属芽孢杆菌属。由gyr B基因序列同源性分析及构建系统发育树对菌株YSSNJ-005继续鉴定。BLAST在线对比可知:菌株YSSNJ-005为芽孢杆菌属,且与蜡样芽孢杆菌标准菌株Bacillus cereus ATCC14579基因序列同源性达100%,可精确断定菌株YSSNJ-005是蜡样芽孢杆菌。     

高产磷脂酶D的蜡样芽孢杆菌诱变筛选及发酵条件优化

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种天然的磷脂酶D(PLD)生产菌株,为了提高PLD产量,以野生型蜡样芽孢杆菌(B.cereus CICC 20551)为出发菌,使用紫外线和硫酸二乙酯对其进行复合诱变,通过建立的PLD活性高效筛选方法,从大量突变样本中筛选得到一株高产PLD的蜡样芽孢杆菌S6-UD46。将该菌株摇瓶发酵48 h,产酶量达到0.52 U/mL,相比原始菌株(0.32 U/mL)提高了62.5%。对诱导产酶条件与培养基成分进行了优化,确定最佳发酵条件为：以20 g/L牛肉膏为氮源,10 g/L蔗糖为碳源,在600 nm波长下的光密度(OD₆₀₀)达到4左右时加入40 g/L卵磷脂(磷脂酰胆碱含量>90%)对突变菌株S6-UD46进行诱导产酶,在37℃、200 r/min下培养48 h, PLD酶活性可达3.22 U/mL,是优化前的6.19倍。     

D-核糖生产菌的原生质体诱变育种及其发酵条件的研究

以短小芽孢杆菌为出发菌株 ,经过硫酸二乙酯和原生质体紫外诱变 ,定向选育出一株稳定的核糖生产菌 TJ3,该菌株具有莽草酸营养缺陷、耐高糖、以核糖为唯一碳源不生长等遗传标记。在发酵条件试验中 ,采用均匀设计理论 ,利用微机对试验数据进行统计处理 ,确定出以葡萄糖为原料直接发酵生产核糖的优化配比。在最适培养条件下 ,摇瓶发酵平均产核糖 30 .12 mg/m L     

大丽轮枝菌拮抗芽孢菌株的分离、鉴定及两株菌抑菌特性研究

从新疆和硕连作棉田根际土壤中分离到146株芽孢细菌.29株对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)具有拮抗作用的菌株中有9株拮抗性极强.经鉴定,9株拮抗性极强的菌株中有2株属短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),7株与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)相近.抑菌特性实验表明:J-02和J-15的抑菌高峰分别出现在衰亡期和稳定期,对pH的耐受范围分别为5~9和7~9;J-02的热稳定性较好,J-15对温度较敏感,但100℃处理后仍有抑菌活性;J-02能够抑制大丽轮枝菌芽管伸长形成菌丝,J-15可导致大丽轮枝菌菌丝畸形,失去产孢能力.盆栽实验表明,J-02和J-15这2株拮抗菌对棉花黄萎病有明显防治作用.综合结果表明J-02和J-15均有作为棉花黄萎病生防菌的潜能.     

一株耐盐菌GL的分离鉴定及促生特性分析

利用海底的淤泥进行分离挑选得到一株耐盐性较强的菌株，该菌为细长的棒状且菌体较长，菌落发白，用接种针易刮起，发出微臭气息.经过16S rRNA序列比对，该菌株与嗜热脂肪土芽孢杆菌菌株GL(KX254601.1)之间关系可信度达到100%,故将其定名为嗜热脂肪土芽孢杆菌(GL).经过对该菌株在1%～10%盐浓度下生长曲线分析，3%～6%的NaCl浓度内菌株最高OD₆₀₀能达到1.5,但是当盐浓度达到10%时菌株生长受到严重影响.菌株GL在1%～9%盐浓度下长势良好，其最佳生长盐浓度为2%.对该菌种的固氮、产铁载体以及促进种子萌发能力进行分析，可以看到在0～2.5%盐浓度下，Ashby无氮培养基上菌落周围均有透明圈，说明该菌株在0～2.50%的盐浓度下具有较好的固氮能力.菌株在0～150 mmol/L的盐浓度下可以产生铁载体，能够促进小白菜种子在盐胁迫条件下萌发和生长，说明该菌株在盐胁迫条件下具有较好的促生特性.     

腾冲热海嗜热芽孢杆菌的分离鉴定

从云南腾冲热海温泉中分离得到26株嗜热芽孢杆菌菌株,对其中一株嗜热芽孢杆菌菌株NHH4进行电镜形态、生长特征、碳源、氮源等分析。该菌株细胞形态为杆状,产芽胞,革兰氏染色阳性,严格好氧,其最适生长温度为55℃,最适为pH7.5。能利用葡萄糖、蔗糖、D-果糖、D-甘露糖,不能利用麦芽糖、乳糖、D-木糖、L-鼠季糖。通过对其16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,NHH4与Bacillus licheniformis strain N8的序列相似性为99%,将此菌株鉴定为嗜热地衣芽胞杆菌菌株。     

瓦雷兹芽孢杆菌FZB42菌株拮抗两种树木病原真菌及其机理研究

镰刀菌和交链孢菌是导致树木病害的两种常见病原真菌,常导致苗圃植物严重的危害和经济损失。瓦雷兹芽孢杆菌FZB42菌株具有高效生防性能和植物促生活性,为进一步探明该菌株的生防机理,首先测试了FZB42对镰刀菌和交链孢菌的抑制效果。在了解该菌株抑制作用的基础上,进一步构建质粒,通过同源重组的方式构建了FZB42的3个抗生素合成缺损菌株(ΔbmyA,ΔfenA、ΔbmyAΔfenA)。对这3个突变株进一步测试表明,FZB42合成的物质bacillomycin D和fengycin是抑制两种真菌生长的重要原因,且这两种物质的拮抗作用具有明显的协同强化效果。     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株诱导马尾松抗松材线虫病研究

【目的】蜡样芽孢杆菌NJSZ-13是1株能杀死松材线虫的松树内生细菌,研究该菌株能否诱导马尾松抗松材线虫病,为进一步开发利用该菌株抗松材线虫病提供理论依据。【方法】通过对2年生马尾松苗根部施用NJSZ-13菌株菌悬液和灭活的菌悬液后4 d再接种松材线虫,以观察不同处理的病情发展。测定该菌诱导处理后4天内和接种松材线虫AMA3虫株后28天内马尾松体内防御相关酶活性的变化。【结果】接种松材线虫后42 d,菌悬液和灭活菌悬液处理诱导马尾松抗松材线虫病的效果达54%和33%,且发病时间延迟。接种NJSZ-13菌株后,马尾松体内丙二醛(MDA)含量减少,过氧化氢酶(CAT)活性降低,而过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性均显著高于对照;接种松材线虫后,菌悬液和灭活菌悬液处理的马尾松这5种酶活性明显高于未接种菌株的马尾松苗。总体上,菌悬液处理比灭活菌悬液处理的马尾松防御相关酶活性变化显著。【结论】蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株能诱导马尾松抗松材线虫病,并且菌悬液的诱抗效果最佳。     

一株热纤梭菌的分离及其纤维素分解活性的初步研究

从牛粪中分离到一株能分解纤维素的高温厌氧梭状芽孢杆菌。该菌接触酶阴性,革兰氐染色阴性。细胞杆状或稍弯(5～10×0.6～0.8μm)。芽孢卵圆形,端生,直径为1.0～1.3μm。极生丛鞭毛,运动。老龄时菌体常呈长丝状(15～30×0.4～0.6μm)。以断裂方式繁殖。最适生长温度为60～65℃,最适pH为6.5～7.0。发酵产物有H_2、CO_2,乙酸、甲酸、乳酸和乙醇等。发酵液中无色素。在纤维素琼脂滚管中形成透明、直径为5～l5mm的圆形分解圈。该菌株在以蛋白胨为唯一碳源和氮源时不生长,能迅速利用葡萄糖或纤维二糖生长。在纤维素上生长时产生孢外纤维素酶,在纤维二糖或葡萄糖上生长时不产生纤维素酶。将在纤维二糖或葡萄糖上旺盛生长的菌接入纤维素培养基中时,需经过10天以上的延迟期才能恢复纤维素分解能力,说明该菌株的纤维素酶是诱导酶。酶的最适温度为65℃,pH为7.2。该菌株的形态、生理生化及酶学性质与Clostridium thermocgllum十分相似,鉴定为同一个种。     

亚硝基胍与紫外诱变选育高效解钾菌株

为构建遗传背景差异较大、解钾性能稳定提高的候选菌库,选用课题组分离的蜡样芽孢杆菌L18（Bacillus cereus,KF494191) 为出发菌株,对其分别进行亚硝基胍（NTG）和紫外（UV）诱变处理,经四苯硼钠-季铵盐显色初筛,摇瓶发酵复筛,获得42株解钾能力显著增强的突变株,其中：诱变株L18-NTG-151和L18-UV-68发酵液钾质量浓度分别为126.74,121.69 mg/L,与出发菌株相比分别提高了63.64%和57.12%.结果表明亚硝基胍和紫外线诱变处理能显著提高蜡样芽胞杆菌的解钾能力.     

一株拮抗芽孢杆菌的分离鉴定及其β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆

 植物真菌病害是影响农业生产的主要因素之一,连作栽培导致病害逐年加重,为获得能够抑制病原真菌的生防菌以解决真菌病害防治难题,通过平板对峙实验及分子鉴定、抑菌活性物质分析、葡聚糖酶基因克隆及分析,获得一株对多种植物病原真菌具有显著抑制作用的芽孢杆菌,菌株编号为L103。16S rDNA及看家基因序列分析表明,该菌株为巨大芽孢杆菌,羧甲基纤维素钠平板筛选及刚果红染色实验发现该菌具有很强的产纤维素酶(CMC酶)的能力,根据GenBank中巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因(HM130670.1)序列设计引物,将扩增得到的1482bp大小的片段克隆到载体pMD18-T上,测序并通过GenBank数据库BLAST分析显示该序列与一株Bacillus sp. HB102的内切β-1,4-葡聚糖酶基因序列一致性达到95%,而与Bacillus subtilis的β-1,4-内切葡聚糖酶基因一致性为85%,进一步分析该菌株产生的抗病活性物质并对其进行改良将为该菌在今后的真菌病害防治应用中提供理论基础。