黄犏牛与黄牛b-Boule基因编码区序列、结构、表达模式和睾丸组织表达水平的差异分析

Boule是动物精母细胞减数分裂过程中的必需蛋白,与精子发生减数分裂阻滞、雄性不育等密切相关.文中通过PCR扩增和克隆测序获得黄犏牛b-Boule基因的cDNA全序列,生物信息学分析发现黄犏牛b-Boule基因编码区全长885 bp,具有典型的RNA识别基序(RRM)和DAZ重复序列;与黄牛氨基酸序列的同源性为98.65%,仅在C-末端有4个氨基酸的差异,典型结构域的氨基酸序列和高级结构相同.RT-PCR发现b-Boule基因在黄牛和黄犏牛睾丸组织中特异表达,原位杂交显示b-Boule存在于初级精母细胞和次级精母细胞的细胞质中.荧光定量PCR发现黄牛睾丸组织中b-Boule基因表达水平显著高于黄犏牛(P<0.05),且黄犏牛精子发生减数分裂阻滞的表型与人、小鼠BDule基因表达缺失或降低引起的不育表型一致,因此推测b-Boule基因可能在精母细胞减数分裂过程中发挥重要作用,且与黄犏牛雄性不育有密切的关系.     

南方鲇(Silurus meridionalis)神经肽Y基因cDNA克隆及组织表达分析

以南方鲇(Silurus meridionalis)为对象,运用RT-PCR和RACE技术,获得神经肽Y(Neuropeptide Ty-rosing,NPY)基因cDNA的全序列.该基因cDNA全长743bp,包括3′非编码区(UTR)373bp,5′非编码区(UTR)82bp,开放阅读框(ORF)288bp,编码95个氨基酸.与其他脊椎动物进行同源性分析发现,南方鲇NPY序列与斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的同源性最高,达79%,其次为瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii),同源性达76%.进化树分析也表明,南方鲇与斑点叉尾鮰和瓦氏黄颡鱼聚为一支.qPCR显示,南方鲇NPY mRNA在脑、心脏、肾脏、鳃、胃、肠和肝等7种组织中都有不同程度的表达,其中在脑中的表达量最高.     

大黄鱼cyclin B1和cdc2 cDNA序列特征及组织表达分析

成熟促进因子(MPF)是诱导细胞从G2期转入M期的关键因子,在配子成熟过程中具有重要作用.MPF由周期蛋白B(cyclin B,CB)和周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK1,由cdc2基因编码)2个亚基组成.本研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)cyclin B1(Lc-cb1)和cdc2(Lc-cdc2)基因的cDNA序列,并分析了这2个基因mRNA的组织表达特征,为解析MPF在大黄鱼性腺发育和配子成熟的作用机理奠定基础.Lc-cb1基因全长cDNA 1 882bp,可编码397个氨基酸的蛋白;Lc-cdc2基因全长cDNA序列1 151bp,可编码303个氨基酸的蛋白.基于Lc-cb1 cDNA序列推导的氨基酸序列与6种脊椎动物的CB1氨基酸序列有较高相似性(67%~84%),并具有周期蛋白盒、毁坏盒、以及蛋白酶K位点(RRxSK)等CB预期特征.基于Lc-cdc2的cDNA序列推导的氨基酸序列也与其他6种鱼类的CDK1氨酸酸序列有较高相似性(88%~97%),并具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域、ATP结合相关的保守序列(GxGxxGxV)、周期蛋白结合相关的PSTAIRE序列等CDK1的预期特征.可见,本研究克隆获得的2条序列是Lc-cb1和Lc-cdc2 cDNA全长.实时荧光定量PCR结果显示,Lc-cb1和Lc-cdc2的2个基因mRNA表达具有相似的组织特异性,在性腺中mRNA水平均远远高于其他组织,表明Lc-cb1和Lc-cdc2是大黄鱼性腺发育相关的重要基因.     

珍珠鸟和家鸡甲状旁腺激素3型受体(PTH3R)的结构与表达图谱分析

甲状旁腺激素(PTH)与动物钙稳态调控和骨代谢平衡相关,其生理作用是通过甲状旁腺激素受体(PTHR)介导。甲状旁腺激素受体家族包括三个不同的亚型,其中甲状旁腺激素3型受体(PTH3R)在非哺乳类脊椎动物生长发育过程中起着重要作用,然而PTH3R在鸟类中的研究则相对较少。 本研究采用RT-PCR方法,首先克隆了珍珠鸟和家鸡的PTH3R基因全长cDNA序列。结果显示,家鸡PTH3R (cPTH3R) cDNA全长1632 bp,编码543个氨基酸,珍珠鸟PTH3R(zPTH3R-w) cDNA序列全长1563 bp,编码520个氨基酸,其蛋白均含有信号肽序列、七次跨膜区等特征性结构。此外,在珍珠鸟中还发现一个新剪接变体zPTH3R-v1,其cDNA序列全长1468 bp,编码488个氨基酸,其缺失了第3外显子进而导致第1跨膜结构域缺失。利用生物信息学方法,我们还对珍珠鸟和家鸡PTH3R蛋白序列进行三维建模。 采用RT-PCR方法,本研究也对珍珠鸟PTH3R基因进行组织表达分析。结果显示,zPTH3R及其剪切变体zPTH3R-v1在珍珠鸟脑及外周组织中广泛表达。珍珠鸟和家鸡PTH3R基因的成功克隆与结构解析,将为下一步开展PTH3R在鸟类中的功能研究奠定重要基础。     

稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因 cDNA 克隆及组织表达分析

铜蓝蛋白(Ceruloplasmin,Cp)是一种重要的铜转运蛋白,合成于肝脏并参与生物体铁的代谢,在医学上是各种炎症、感染、中毒及癌症疾病的标志性蛋白.铜蓝蛋白的研究已在多种真骨鱼类中被报道,文中第一次在稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)中报道此基因.采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因,使用荧光定量PCR的方法构建了该基因组织表达谱.序列分析表明稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因包含3 264bp全长编码序列,该序列编码1 087个氨基酸,其核苷酸和氨基酸序列与斑马鱼同源性最高(分别为88.1%和90.3%).理论相对分子质量和等电点分别为124 429.1D和6.41.荧光定量PCR检测表明该基因在肝脏和脾脏中相对表达量最高,在肌肉和鳃中相对表达量最低.使用氨基酸序列进行蛋白结构保守域分析,结果表明铜蓝蛋白基因在脊椎动物中是相对保守的,推测其功能也与其他物种相似.这为进一步研究稀有鮈鲫该基因的功能及其应用奠定了基础.     

人类锌指蛋白新基因ZNF641的克隆及表达

从人类心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个新的人类锌指基因ZNF641,该基因的cDNA序列全长4．9kb,编码一个含438个氨基酸的蛋白质,从进化上看,该蛋白质在从小鼠到人的脊椎动物中都高度保守．Northern Blot分析显示：ZNF641在人类的多数组织中都有表达,尤其是在骨骼肌中有较高水平的表达．而亚细胞定位则显示ZNF641在细胞核及细胞质中均有定位．     

赤点石斑鱼MHC IA基因的克隆与表达多态性分析

采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)非特异性免疫因子MHC IA基因的4个cDNA全序列,序列全长为1 680bp,含有3′UTR、启动子、多肽结合区(α1)、IGC区(α2)、跨膜区、胞质区和5′UTR区,编码区大小为1 074～1 080bp,共编码357～359个氨基酸,推测蛋白质分子质量约41.66ku.氨基酸序列分析发现赤点石斑鱼MHC IA分子具有经典MHC蛋白分子的空间结构,在多肽结合区则存在极其丰富的变异.利用Real time PCR和SSCP技术研究了赤点石斑鱼MHC IA的组织表达特异性和表达多态性,发现其在头肾、心、肝等12个组织器官中均能有效表达,在头肾,脾,胸腺等免疫组织表达量不仅高,表达多态性也异常丰富,而在与外界环境接触较多的鳃、肌肉、肠等组织表达较弱.此外,根据MHC IIB分子中相对保守的IGC区氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树,也表明了该分子的IGC区氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好标记.     

猪抑胃肽/葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(GIP)基因的克隆与组织表达分析

本研究采用RT-PCR方法,克隆长白猪(Landrace)GIP基因全长cDNA序列,并对其在家猪组织中的表达情况进行分析.结果显示:长白猪GIP(pGIP)cDNA全长435bp,编码144个氨基酸GIP的前体蛋白;该前体蛋白含有信号肽序列,经蛋白酶水解后产生GIP成熟肽.与人、小鼠GIP表达图谱类似,GIP mRNA也在长白猪小肠及肾脏中有较高水平表达.     

文昌鱼Rbx1同源基因的克隆，进化分析和表达图式的研究

在青岛文昌鱼中首次克隆到一个RING box同源基因，对其进行了序列特征和系统进化学分析，并且研究了该基因的胚胎发育和成体表达图式。AmphiRbx1演绎的蛋白序列与已知其他无脊椎动物和脊椎动物的同源分子表现出很高的相似性。利用原位杂交和RT-PCR技术研究该基因的表达，结果显示AmphiRbx1在胚胎发育各期均有表达，特别是在卵裂期胚胎和有高速分裂细胞的组织中有很强的表达。实验结果表明，Rbx1基因在进化中相当保守，AmphiRbx1可能在细胞分裂的调节中发挥作用。     

眼斑拟石首鱼肽聚糖识别蛋白2的基因克隆与组织表达特性

采用同源克隆技术获得了眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的肽聚糖识别蛋白2基因(命名为So-pglyrp2).So-pglyrp2的cDNA全长1 729 bp,含有1个1 446 bp的开放阅读框,编码的482 aa前体蛋白带有1个21 aa信号肽;So-pglyrp2基因由4个外显子和3个内含子构成.序列比对分析表明,So-pglyrp2存在1个保守的PGRP结构域,其氨基酸序列与已报道的脊椎动物pglyrp2的同源性最高,一致性为57.1%~82.8%.RT-PCR分析表明,So-pglyrp2基因在肝脏强烈表达,在性腺、肠和胃组织弱表达,在其他组织不表达.研究结果为阐明鱼类pglyrp2基因结构、了解低等脊椎动物pglyrp2的进化地位、探讨鱼类pglyrp2的免疫学功能奠定了坚实的基础.