结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化

探讨结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化。用激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测不同时期感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率,比较结核分枝杆菌Hsp16.3基因缺失突变株与正常株感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的时相性变化。激光共聚焦显微镜检测结果显示:结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株(△H37Rv)、卡介苗菌株(BCG)以及卡介苗株Hsp16.3基因缺失突变株(△BCG)均被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。流式细胞技术检测结果显示:小鼠感染△H37Rv菌株后,巨噬细胞的凋亡率逐渐上升,至感染7d时达到高峰,随后逐渐降低,1～7d内,各时间段△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率均显著高于H37Rv感染组,9～11d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率反而低于H37Rv菌株组,但13～15d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率又呈现出比H37Rv感染组高的现象,差异均有统计学意义(P<0.05)。△BCG组凋亡率1～7d内呈现明显下降趋势,7d后巨噬细胞凋亡率变化趋于平稳,且1～5d内,△BCG组凋亡率显著高于BCG组(P<0.05),7～15d内,△BCG组与BCG组巨噬细胞凋亡率无明显差异。结果表明:与结核分枝杆菌H37Rv株野生株相比,结核分枝杆菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株在感染的早期和晚期对小鼠肺泡巨噬细胞有更强的致凋亡作用,而这种致凋亡作用与结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因的缺失相关,说明在结核分枝杆菌感染的早期和晚期,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的表达能够抑制宿主巨噬细胞的凋亡。     

SUMO融合表达对淀粉酶N-Amy活性的影响

前期解析了一个来自嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的新型的碱性淀粉酶Amy703,该酶含有一个未知功能的N端结构域,将该结构域缺失后得到的突变体N-Amy相对野生型Amy703比酶活提高了35倍;底物结合实验显示Amy703可以结合不可溶性底物,单独的N端结构域和N端结构域缺失突变体N-Amy都不能结合,推测N端结构域会造成催化结构域的结构变化从而引起比酶活的大幅提高.为了进一步探究Amy703特异的N端结构域造成酶活显著下降的原因,将Amy703的N端结构域替换为SUMO蛋白,实验结果显示裂解液上清的SUMO/N-Amy条带比Amy703粗亮,验证了SUMO蛋白的促可溶性作用;但纯化后的融合蛋白SUMO/N-Amy的比酶活显著低于N-Amy,仅和野生型Amy703的比酶活相当,表明SUMO与N-Amy的融合显著降低了酶活,同时也预示着N端多一段结构域会影响到催化结构域的结构变化.此外,对SUMO/N-Amy融合蛋白是否与底物结合进行了探讨,为进一步解析Amy703的N端结构域功能提供了实验依据.     

天冬氨酸酶C端缺失突变酶基因的克隆和表达

利用多聚酶链反应（PCR）技术,从天冬氨酸酶基因的3'-端删除42个碱基,缺失突变基因经克隆、转化和筛选,得到一株有C端缺失14肽的天冬氨酸酶突变体表达的转化子．突变酶纯酶活性为野生型酶的1．21倍．圆二色谱和荧光光谱的研究表明,突变酶的结构比野生型酶松散或更具柔性,天冬氨酸酶C端14肽不是其功能所必需的．     

可逆光致变色的藻红蓝蛋白α亚基分子设计

从层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基基因表达质粒pGEMD-pecA出发，通过酶切、削平或补充补末端及重新环合等技术，使其后的阅读框发生移码突变，从而到C－端缺失24个和36个氨基酸的两个缺失突变体pGEMD-pecA-C24和pGEMD-pecA-C36，用PCR技术将已突变的基因片段转入表达载体pET30中，得到pET30-pecA-C24和pET30-pecA－C36，获得高效表达，利用PCR技术从pGEMD-pecA中扩增出N－端缺失20个和32个氨基酸pecA的突变基因片段，并克隆于表达载体pET30中,得到pET30-pecA-N20和pET30-pecA-N32，获得高效表达，两个C－端缺的突变的脱辅基蛋白无论有或无藻红蓝蛋白连接／异构酶催化，均不能与藻蓝胆素共价偶联，两个N－端缺失突变脱辅基蛋白均能在藻红蓝蛋白连接／异构酶催化下与藻蓝胆系共价偶联，且色素从藻蓝胆素转化为藻紫胆素。     

结核分枝杆菌Hsp16.3单克隆抗体的制备及其特性鉴定

制备抗结核分枝杆菌Hsp16.3的单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。将含目的基因的表达载体pProEXHTb-Hsp16.3,通过E.coli DH5α诱导表达,获得含有6譎is的Hsp16.3蛋白,采用Ni-NTA纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化,并用透析方法进行蛋白复性。将复性的蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。将获得的Hsp16.3阳性杂交瘤细胞株分别利用间接ELISA法和Western blot方法进行效价、相对亲和力及特异性的测定。获得了三株Hsp16.3的单克隆抗体,分别命名为3H6F9、1D5E1和4H8G6,其效价分别为1:1?07、1:1?06和1:1?06,相对亲和力分别为0.0001 mg/mL、0.001 mg/mL和0.001 mg/mL,并且无交叉反应性。所获得的结核分枝杆菌Hsp16.3的单克隆抗体效价高、特异性强,为进一步研究Hsp16.3在结核分枝杆菌潜伏感染中的作用提供了有效的工具。     

利用拟南芥鉴定双孢蘑菇Hsp20和Adcs基因的耐温功能

双孢蘑菇2个差异表达基因热休克蛋白基因(Hsp20)和4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶基因(Adcs)通过根癌农杆菌(Agrobacterium)介导的花序浸渍法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),经草铵磷筛选、聚合酶链式反应(PCR)鉴定和蛋白质印迹(Western blot)鉴定表明,Hsp20基因和Adcs基因已整合到拟南芥基因组中并过表达.对转基因植株和野生型对照进行高温胁迫,比较其耐热性差异.结果显示:经过45℃热激1h处理,Hsp20基因转化拟南芥下胚轴恢复生长,部分幼苗存活;Adcs基因转化拟南芥与野生型一样下胚轴未恢复生长,幼苗基本未存活.实验表明,Hsp20基因对蘑菇的耐热性有直接作用,而Adcs基因对蘑菇的耐热性可能无直接作用.     

梅毒螺旋体47ku抗原的分段表达及抗原表位分析

通过大肠杆菌表达系统表达了梅毒螺旋体47 ku膜蛋白及其N端和/或C端缺失的重组蛋白共15个,经亲和层析纯化,并通过免疫印迹和酶联免疫实验检测这组蛋白与梅毒病人血清的反应性.结果发现所有包含D结构域的重组蛋白的免疫反应性显著高于不含D结构域的蛋白,提示D结构域中可能包含47 ku膜蛋白上的一个免疫优势表位.     

卡介苗Hsp16.3基因突变株对小鼠巨噬细胞RAW 264.7自噬的影响*

构建及鉴定卡介苗(BCG)Hsp16.3基因突变株,观察该突变株对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增Hsp16.3基因两侧分子量分别为663 bp和684 bp的两个DNA片段,并将这两个目的片段分别插入p KO载体上相应的位点。通过硫酸卡那霉素筛选,利用双酶切以及测序的方法,获得阳性重组质粒p KO-Hsp16.3。将阳性重组质粒p KO-Hsp16.3电转入BCG感受态细胞中,经过硫酸卡那霉素和蔗糖两次筛选,得到BCG Hsp16.3基因突变株。将筛选培养的BCG Hsp16.3突变株用于小鼠巨噬细胞的感染实验,并通过Western Blot和细胞免疫荧光技术对自噬相关蛋白的表达水平的变化进行观察及分析。成功获得重组质粒p KO-Hsp16.3的阳性克隆;电转化该重组质粒,并经过硫酸卡那霉素筛选和蔗糖反筛选,成功得到BCG Hsp16.3基因突变株。通过Western Blot以及免疫荧光分析发现,BCG Hsp16.3基因的突变株促进了小鼠巨噬细胞自噬的发生。     

Exendin-4螺旋结构对生物活性及稳定性的影响

针对Exendin-4的螺旋结构特点,采用去掉螺旋序列、用3个连续Ala替换螺旋以及Gln13替换为Tyr13的方式对N端α-螺旋及C端α-螺旋进行改造,设计出4个结构模拟物.通过圆二光谱和荧光光谱进行结构分析,结合模拟物生物活性实验,分析Exendin-4螺旋结构与生物活性的关系.结果表明:Exendin-4的N端螺旋比C端螺旋对生物活性影响更大;在抗二肽基肽酶(DPPⅣ酶)的稳定性实验中,C端螺旋比N端螺旋具有更好维系Exendin-4稳定性的作用;螺旋结构中Tyr13可作为提高Exendin-4生物活性的重要优化位点.     

影响HIV-GP41N端1/2在E.coli中表达的两段氨基酸序列界定

GP41蛋白二级结构预测显示 ,前 1 /2片段的 N端 ( 4～ 2 6位氨基酸 )和 C端 ( 1 67～ 1 89位氨基酸 )各有一个富含疏水氨基酸的穿膜螺旋 (可能性 >0 .9) ,分别从 N1 (前 1 /2片段无 C端穿膜螺旋 )的 N端和 N6(前1 /2片段无 N端穿膜螺旋 )的 C端进行缺失构建一系列缺失突变体 ,只有 p ET-N2 ,p ET-N3 ,p ET-N4,p ET-N5在大肠杆菌中获得高效表达 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 % ,Western blot显示表达蛋白与 HIV阳性血清有良好的反应性 .而 p ET-N1 ,p ET-N6在大肠杆菌中表达量很低或不表达 .从而证明 1～ 6位 ,1 84～ 2 0 1位氨基酸是影响 gp41基因 N端 1 /2片段表达的主要因素     

Exendin-4螺旋结构对生物活性及稳定性的影响

针对Exendin-4的螺旋结构特点, 采用去掉螺旋序列、 用3个连续Ala替换螺旋以及Gln13替换为Tyr13的方式对N端α-螺旋及C端α-螺旋进行改造, 设计出4个结构模拟物. 通过圆二光谱和荧光光谱进行结构分析, 结合模拟物生物活性实验, 分析Exendin-4螺旋结构与生物活性的关系. 结果表明：  Exendin-4的N端螺旋比C端螺旋对生物活性影响更大； 在抗二肽基肽酶（DPPⅣ酶）的稳定性实验中, C端螺旋比N端螺旋具有更好维系Exendin-4稳定性的作用； 螺旋结构中Tyr13可作为提高Exendin-4生物活性的重要优化位点.     

N端延长对大肠杆菌铁蛋白结构稳定性及其自组装的影响

【目的】研究延长的N端肽链对铁蛋白结构稳定性及蛋白自组装的影响,为在N端融合生物分子构建功能性纳米材料奠定基础。【方法】在大肠杆菌铁蛋白N端添加6个组氨酸残基,所得重组蛋白采用体积排阻色谱、非变性凝胶电泳和圆二色谱等手段与野生型铁蛋白的聚合态、二级结构及热力学稳定性进行对比分析。【结果】体积排阻色谱表明野生型铁蛋白在溶液中以24聚体和二聚体混合物形式存在,但突变蛋白仅以二聚体的形式存在; 非变性凝胶电泳实验结果与体积排阻色谱结果吻合,即突变蛋白仅显示1条带,且与野生型铁蛋白的2聚体迁移位置基本相同; 圆二色谱结果表明突变蛋白的二级结构与野生型类似,呈典型的α-螺旋结构,突变蛋白的T_m值比野生型降低了1.1 ℃。【结论】在大肠杆菌铁蛋白亚基的N端增加6个组氨酸残基所得突变蛋白的二级结构没有发生明显变化,但却无法形成24聚体壳状结构,在溶液中仅以二聚体的形式存在,且热力学稳定性有所降低。N端的延长可能导致铁蛋白单体构型发生改变,因而无法进一步组装成壳状结构。     

中华鳖tyrp-1基因的生物信息学分析

为阐明中华鳖酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP-1)基因tyrp-1及蛋白质结构与性质,利用相关软件、数据库和方法对其进行了生物信息学分析.结果显示,基因转录本全长为2 829bp,编码535个aa.预测TYRP-1蛋白分子质量为60.16ku,理论等电点为5.35,为不稳定蛋白;N端含有信号肽,与信号识别蛋白结合后,促进其穿越内质网膜进入内质网腔;C端含有跨膜结构域,锚定于细胞膜上,发挥重要的生物学功能;TYRP-1蛋白含有2个铜离子结合结构域,与DCT蛋白有明显的相互作用.     

α—二乙烯三胺甲基三乙氧基硅烷的合成及其应用

本文以甲基三氯硅烷为原料,经氯化、乙酯化后得氯甲基三乙氧基硅烷,再与二乙烯三胺反应,制得了α—二乙烯三胺甲基三乙氧基硅烷(简称化合物Ⅰ)。化合物Ⅰ能加速室温硅橡胶硫化;用化合物Ⅰ制得的氨基硅树脂通过N,N’-二环巳基羰二亚胺(简称D、C.C.I)与胰酶偶联成具有生物活性的有机硅固胰酶衍生物Ⅱ,并测定了最适pH和最适温度.     

人CREB4转核机制的初步研究

cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding proteins，CREB）是一个哺乳动物转录因子家族，通过cAMP 反应元件（cAMP response element，CRE）调节cAMP和钙离子依赖性基因的表达.CREB4是CREB转录因子家族的一员.经酵母双杂交筛选人胎脑文库发现CREB4^215-279aa可能与核转运因子kayopherinα2相互作用，提示karyopherinα2可能参与CREB4的跨膜转运过程.亚细胞定位结果显示，CREB4全长定位于细胞质，而缺失C端假定转膜结构域的CREB4^1-279aa蛋白则转移至细胞核内.荧光共定位进一步显示，CREB4和karyopherinα2共定位于细胞质中，CREB4^1-279aa和karyopherinα2共定位于细胞核中.结果提示C端被切除之后，CREB4被karyopherinα2转运到核内发挥转录作用.     

异三聚体G蛋白在拟南芥生长过程中的作用

利用拟南芥的野生型和异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体(gpα1-1,gpα1-2)和超表达突变体(wGα,cGα)为材料,对植株生长发育的一些形态指标进行了观测比较．结果表明2个缺失突变体的植株高度、叶片宽度、长角果果柄长度都明显超过野生型,而超表达突变体的部分指标与野生型相比也有明显差别．实验结果表明,异三聚体G蛋白参与某些器官生长发育的调节,初步证明G蛋白α亚基在伸长生长过程中可能起负调节作用。     

复性的乙型肝炎病毒X蛋白突变体HBxΔNΔC具有体外生物学活性

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在肝炎引起的肝癌病变中作为一个多功能调节因子起着关键的作用.对HBx的功能有非常多的体外研究报导,而由于HBx蛋白难以溶解和稳定使得体外的研究报导非常少.我们根据肝癌患者中最常见的截短突变体,在大肠杆菌包涵体中重组表达了一个保留了第12～127位氨基酸的、N端和C端截断的突变体HBxΔNΔC,并使用变复性的方法将其复性溶解.分子筛显示HBxΔNΔC为单体;圆二色谱显示HBxΔNΔC包含有5％的α-螺旋,30％的β-折叠和65％的其他结构.复性的HBxΔNΔC能从人HepG2细胞中拉下(pull-down)肿瘤抑制因子p53和DDB1蛋白,它还能刺激肝细胞的迁移.腹腔注射1μg/g的HBxΔNΔC能明显刺激小鼠肝的生长.这些结果显示HBxΔNΔC具有一定的生物学活性,它可以用来研究体外的HBx结构和分子作用机制.     

复性的乙型肝炎病毒X蛋白突变体HBxΔNΔC具有体外生物学活性（英文）

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在肝炎引起的肝癌病变中作为一个多功能调节因子起着关键的作用.对HBx的功能有非常多的体外研究报导,而由于HBx蛋白难以溶解和稳定使得体外的研究报导非常少.我们根据肝癌患者中最常见的截短突变体,在大肠杆菌包涵体中重组表达了一个保留了第12~127位氨基酸的、N端和C端截断的突变体HBxΔNΔC,并使用变复性的方法将其复性溶解.分子筛显示HBxΔNΔC为单体;圆二色谱显示HBxΔNΔC包含有5%的α-螺旋,30%的β-折叠和65%的其他结构.复性的HBxΔNΔC能从人HepG2细胞中拉下(pull-down)肿瘤抑制因子p53和DDB1蛋白,它还能刺激肝细胞的迁移.腹腔注射1μg/g的HBxΔNΔC能明显刺激小鼠肝的生长.这些结果显示HBxΔNΔC具有一定的生物学活性,它可以用来研究体外的HBx结构和分子作用机制.     

一种高效免疫佐剂热休克蛋白gp96的酸性区和两侧中间区对其N端构象及多肽结合能力的调节作用

gp96(glucose-regulated protein,GRP94)是热休克蛋白90家族(HSP90 family)中的一员.由于其在维持内质网蛋白中间过渡态的空间构型以及免疫反应中有重要作用,因此近年来被作为分子伴侣蛋白和免疫佐剂引起广泛关注,但是关于gp96生物功能的彻底阐明还将依赖于对其结构的深入研究.在试验中我们构建了不同的gp96片段,旨在寻找gp96的重要功能区.通过凝胶分子筛和EGS交联实验,发现gp96中间酸性区可以调节gp96 N端的寡聚化状态;而固相ELISA实验显示,包含中间酸性区的N端重组蛋白与肽的结合有高度饱和性,这些结果表明中间酸性区对gp96的寡聚化以及多肽结合能力有内在的调节作用.这一研究对gp96生物功能的阐明以及临床应用提供了理论基础.     

重组果蝇Merlin蛋白的表达与纯化

NF2基因的的缺失会导致Ⅱ型多发性神经纤维瘤的发生.NF2又称Merlin,和ERM蛋白家族成员类似,Merlin蛋白N端的FERM结构域与C端的CTD结构域存在分子内的相互作用,从而形成一种自抑制的闭合构象;当Merlin蛋白N、C端分子内的相互作用被破坏时,能释放出N端的FERM结构域,从而能与许多效应因子相互作用...