拟南芥CARK3与RCAR12相互作用的研究

植物激素ABA是植物应对非生物胁迫的响应因子,广泛参与了植物生长发育的调控.ABA结合其受体后抑制PP2Cs的磷酸酶活性,释放SnRK2s,从而启动ABA信号转导途径.本文采用酵母双杂交系统,GST-pull down技术研究蛋白质激酶CARK3与ABA受体RCAR12在体外的相互作用,结果显示CARK3和RCAR12共转入酵母后,在三缺平板上能够正常生长;经His-Tag抗体检测,CARK3与RCAR12出现明显且单一的条带.同时,采用双分子荧光互补实验研究CARK3与RCAR12在体内的相互作用,结果显示CARK3与RCAR12共转化烟草后能观察到较强的荧光.体内外实验表明,CARK3与RCAR12存在明显的相互作用,CARK3可能通过直接磷酸化ABA受体RCAR12来调控ABA信号途径的生理应答.     

拟南芥蛋白质激酶CARK7与ABA受体RCAR12相互作用的研究

脱落酸(ABA)受体RCARs在ABA信号传导过程中起关键作用,研究ABA受体的相互作用蛋白质对进一步了解植物抗逆的分子机制有重要的意义.本研究通过酵母双杂交发现CARK7与ABA受体RCAR12共转化酵母能在营养缺陷型平板SD/-Trp-Leu-Ade上生长.将CARK7与RCAR12分别克隆到原核表达载体pET-28a(+)和pGEX-6p-1中,构建融合蛋白表达载体,并进行原核表达和亲和纯化.纯化所得蛋白进行GST-pull down实验,结果表明RCAR12能够把CARK7蛋白拉下来.上述结果说明CARK7与RCAR12在体外存在相互作用.进一步通过双分子荧光互补实验发现CARK7与RCAR12在烟草叶片表皮细胞中能产生荧光信号,说明两者在体内同样具有明显的相互作用.     

酵母双杂交筛选与脱落酸受体相互作用的蛋白质及其重转酵母的验证

脱落酸（abscisic acid,ABA）是一种重要的植物激素,它能使植物适应逆境胁迫,从而调节植物的生长发育状况.现今ABA受体已被公认为RCARs/PYR/PYLs家族蛋白.本实验通过拟南芥为模式植物,利用酵母双杂交系统共转化方法从拟南芥cDNA文库中筛选与RCAR3相互作用的蛋白质,获得多个阳性克隆,从中选取一个与生长素调节相关的基因NIT1的全长cDNA重新转化酵母验证,发现与RCAR3仍然有相互作用,排除了假阳性的可能.从而为下一步研究该基因与RCAR3的相互关系做好了准备.     

拟南芥CARK4与RCAR12相互作用的研究

本研究采用酵母双杂交(Y2H)、GST-融合蛋白沉降技术(GST-pull-down)及双分子荧光互补实验(BiFC)实验方法研究蛋白质激酶CARK4与脱落酸受体RCAR12之间的相互作用.酵母双杂交(Y2H)试验显示,缺失氮端的CARK4(CARK4ΔN)与RCAR12具有明显的相互作用.体外GST-融合蛋白沉降技术试验进一步得出CARK4能拉下RCAR12,而不能结合负对照GST,这证明CARK4可以直接与RCAR12相互作用.为了确定CARK4与RCAR12在植物体内是否也存在相互作用,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达来进行BiFC实验,结果表明在烟草中共注射CARK4与RCAR12能发激发荧光,而负对照却没有,这说明CARK4与RCAR12在植物体内存在相互作用.研究结果表明,CARK4与RCAR12在植物体内、体外均具有相互作用.     

酶活性及酶反应动力学分析

运用PCR扩增获得了属于尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)家族UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5的cDNA序列, 构建了三种基因的GST融合表达载体, 使用大肠杆菌对三种基因进行原核表达, 从裂解液上清中获得具有活性的目的蛋白.分别以ABA、对氨基苯甲酸作为反应底物, 通过高效液相色谱法, 测定三种蛋白的酶活力.结果发现除了UGT75B1对对氨基苯甲酸表现出很高的活性以外, 另外两种蛋白仅表现出了低水平的活性.三种蛋白对ABA都表现出了活性, UGT71B6具有最高的酶活力.对UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5三种蛋白对ABA的作用进行了体外酶反应动力学分析, 测定出它们的Km值分别为: 0.73、0.43和0.45mM.以上结果说明UGT75B1对对氨基苯甲酸的活性明显高于ABA, 对氨基苯甲酸是其专一底物.UGT71B6和UGT71C5对ABA都有较高的活性, 两者Km值差距不大.     

UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5酶活性及酶反应动力学分析

运用PCR扩增获得了属于尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)家族UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5的cDNA序列,构建了三种基因的GST融合表达载体,使用大肠杆菌对三种基因进行原核表达,从裂解液上清中获得具有活性的目的蛋白.分别以ABA、对氨基苯甲酸作为反应底物,通过高效液相色谱法,测定三种蛋白的酶活力.结果发现除了UGT75B1对对氨基苯甲酸表现出很高的活性以外,另外两种蛋白仅表现出了低水平的活性.三种蛋白对ABA都表现出了活性,UGT71B6具有最高的酶活力.对UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5三种蛋白对ABA的作用进行了体外酶反应动力学分析,测定出它们的Km值分别为:0.73、0.43和0.45mM.以上结果说明UGT75B1对对氨基苯甲酸的活性明显高于ABA,对氨基苯甲酸是其专一底物.UGT71B6和UGT71C5对ABA都有较高的活性,两者Km值差距不大.     

拟南芥钙依赖蛋白激酶CPK11与ABA响应元件结合因子ABF4相互作用的研究

为研究钙依赖蛋白激酶CPK11参与ABA信号通路的方式,本文利用体外酵母双杂实验(Y2H)以及体内双分子荧光互补实验(BiFC)分析CPK11与ABA响应元件结合因子(ABA-responsive element binding factors, ABFs)ABF4之间的关系.酵母双杂交实验表明CPK11与ABF4存在体外相互作用,双分子荧光互补实验表明CPK11与ABF4存在体内相互作用.以上实验共同证明CPK11与ABF4存在直接相互作用.作为CPK11的同源蛋白CPK4与转录因子ABF4在植物体内也存在相互作用.以上实验表明CPK11及其同源蛋白CPK4可能通过与转录因子ABF4相互作用从而参与钙离子介导的ABA信号通路.     

HPLC法测定UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5酶活性及酶反应动力学分析

运用PCR扩增获得了属于尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UGT）家族UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5的cDNA序列,构建了三种基因的GST融合表达载体,使用大肠杆菌对三种基因进行原核表达,从裂解液上清中获 得具有活性的目的蛋白.分别以ABA、对氨基苯甲酸作为反应底物,通过高效液相色谱法(HPLC),测定三种蛋白的酶活力.分析使用的色谱柱为Kromasil C18反相色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）,使用的流动相是10%-100%水-甲醇或者10%-20%水-乙腈,分别使用醋酸和三氟乙酸调节了pH.使用梯度洗脱的方式对反应样品进行分析.结果发现除了UGT75B1对对氨基苯甲酸表现出很高的活性以外,另外两种蛋白仅表现出了低水平的活性.三种蛋白对ABA都表现出了活性,UGT71B6具有最高的酶活力.对UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5三种蛋白对ABA的作用进行了体外酶反应动力学分析,测定出它们的Km值分别为：0.73、0.43和0.45mM.以上结果说明UGT75B1对对氨基苯甲酸的活性明显高于ABA,对氨基苯甲酸是其专一底物.UGT71B6和UGT71C5对ABA都有较高的活性,两者Km值差距不大.     

拟南芥E3泛素连接酶AtARRE与ABI5相互作用分析

为了阐述AtARRE与ABA信号通路关键转录因子ABI5的作用,本研究采用原生质体瞬间表达系统探究了AtARRE蛋白的亚细胞定位,证明AtARRE蛋白定位于细胞核.随后,采用酵母双杂交和GST-Pull down技术分析了AtARRE与ABI5在体外的相互作用,证明AtARRE与ABI5在体外存在相互作用.最后,本研究采用双分子荧光互补实验进一步分析AtARRE与ABI5在体内的相互作用,结果表明共表达AtARRE与ABI5在植物体内存在相互作用.这些结果共同表明AtARRE可能参与了ABI5介导的植物对逆境的响应.     

拟南芥AtDWD与ABI2相互作用的初步研究

本文以RCAR1为诱饵蛋白通过酵母双杂交（Y2H）技术筛选出了DWD基因编码的蛋白,同时在用ABI2参与筛选的过程中,同样得到了DWD这个基因. 进行了pull down 实验验证它们之间的相互作用,实验结果显示：在体外,RCAR1、RCAR3与DWD之间确实存在相互作用,同时ABI2与DWD也存在相互作用. 其后对DWD结构的进行分析和实验,发现ABI2和DWD的相互作用区域集中在AtDWDC端,大概是145~350位氨基酸之间的WD40结构域里.     

Roles of a sustained activation of NCED3 and the synergistic regulation of ABA biosynthesis and catabolism in ABA signal production in Arabidopsis

ABA, acting as a stress signal, plays crucial roles in plant resistance to water stress. Because ABA signal production is based on ABA biosynthesis, the regulation of NCED, a key enzyme in the ABA biosynthesis pathway, is normally thought of as the sole factor controlling ABA signal production. Here we demonstrate that ABA catabolism in combination with a synergistic regulation of ABA biosynthesis plays a crucial role in governing ABA signal production. Water stress induced a significant accumulation of ABA, which exhibited different patterns in detached and attached leaves. ABA catabolism followed a temporal trend of exponential decay for both basic and stress ABA, and there was little difference in the catabolic half-lives of basic ABA and stress ABA. Thus, the absolute rate of ABA catabolism, i.e. the amount of ABA catabolized per unit time, increases with increased ABA accumulation. From the dynamic processes of ABA biosynthesis and catabolism, it can be inferred that stress ABA accumulation may be governed by a synergistic regulation of all the steps in the ABA biosynthesis pathway. Moreover, to maintain an elevated level of stress ABA sustained activation of NCED3 should be required. This inference was supported by further findings that the genes encoding major enzymes in the ABA biosynthesis pathway, e.g. NCED3, AAO3 and ABA3 were all activated by water stress, and with ABA accumulation progressing, the expressions of NCED3, AAO3 and ABA3 remained activated. Data on ABA catabolism and gene expression jointly indicate that ABA signal production is controlled by a sustained activation of NCED3 and the synergistic regulation of ABA biosynthesis and catabolism.     

A vacuole localized β-glucosidase contributes to drought tolerance in Arabidopsis

The phytohormone abscisic acid (ABA) plays a critical role in plant growth, development, and adaptation to various stress conditions. The cellular ABA level is constantly adjusted to respond to changing physiological and environmental conditions. To date, the mechanisms for fine-tuning ABA levels remain elusive. Here, we report that BGLU10, a member of a multigene family of β-glucosidases, contributes to drought tolerance in Arabidopsis. The T-DNA insertion mutant bglu10 exhibited a droughtsensitive phenoty...     

NCED3基因雌二醇诱导表达对ABA合成酶基因和代谢酶基因表达的影响

胞内ABA信号系统是否存在正反馈调节,一直存在争论.借助于雌二醇诱导的基因表达体系,对ABA合成关键酶基因NCED3超表达,结果发现,由于NCED3限速酶基因的高表达提高了内源ABA信号水平,进而上调了ABA合成酶基因ZEP、AA03等的表达水平,-gitt~了代谢酶基因CYPT07A3的表达.研究显示内源ABA信号水平存在正负两种反馈调节机制,植物特定生理过程中ABA信号池的高低是两种调节的协同结果.     

ABA和GA刺激的ROS代谢调节水稻幼根伸长分析

本文探索水稻幼根生长过程中ABA和GA对ROS代谢的影响,结果显示:低于0.5μmol/L的ABA促进根伸长,超过此浓度的ABA抑制根伸长;H2O2与ABA相似,低浓度促进而高浓度抑制;在观察浓度范围内,GA促进根伸长.利用3,3'-二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)组织化学染色方法检测根尖部位H2O2代谢情况,结果显示,对照、ABA,GA和ABA+GA处理后,根尖分别呈现浅黄色、深棕色、黄色和深棕色,说明ABA比GA诱导较多H2O2产生.进一步研究发现,ABA和ABA+GA分别上调过氧化物酶(peroxidase,POD)活性13.4%和8.37%,GA下调POD活性19.0%;同时,ABA和ABA+GA处理分别下调过氧化氢酶(catalase,CAT)活性14.8%和16.3%,GA则上调CAT活性5.16%.以上结果表明,ABA可能通过上调POD和抑制CAT活性来提高ROS含量,而GA与之相反,严谨控制ROS浓度,促进水稻生长.     

拟南芥CARK11参与ABA介导的生理功能研究

为了探究CARK11在ABA介导的生理进程中的具体作用,本研究以拟南芥哥伦比亚生态型(WT)、CARK11功能缺失突变体cark11和回补激酶丧失CARK11^N203A(com-CARK11m)以及过表达转基因株系(OE-CARK11)为研究对象,探究CARK11在种子萌发、幼苗形态构建、主根生长与干旱响应中发挥的作用.结果显示：相比WT,ABA促进了cark11和com-CARK11m的种子萌发、子叶变绿和主根伸长,而OE-CARK11被抑制. qRT-PCR检测RAB18和RD29a的表达量,发现过表达CARK11促进RAB18和RD29a表达;ABA处理后,这种促进作用更强.干旱实验发现,OE-CARK11耐旱性增加,而cark11和com-CARK11m耐旱性弱于WT.这些结果表明：CARK11作为ABA信号通路的正调控因子抑制拟南芥的种子萌发、子叶变绿和主根生长;同时在干旱胁迫中具有积极作用;另外CARK11在ABA信号途径中的功能依赖激酶活性.     

天然生长抑制物质(ABA)与植物抗旱性

本文综述了水分胁迫下 ABA 对植物抗旱性的影响,ABA 涂调节保持水分平衡外,还具有抑制光合,减弱呼吸,促进或引发一些抗性蛋白,影响多种酶的活力等功能。利用 ABA 控制植物的生长和根的发育探讨其对植物耐旱性的影响。ABA 是植物适应干旱的极为重要的因素。     

ABA与Ca~(2+)-CaM对草莓叶片抗氧化防护酶系统影响

用外源植物激素脱落酸ABA(abscisic acid,ABA)处理草莓叶片,草莓体细胞的抗氧化防护酶活性升高,表明ABA作为植物信号分子可以诱导草莓这一对干旱较为敏感的植物的逆境响应.Fluridone处理未能抑制草莓细胞对外源ABA的响应.进一步研究表明,钙调素(Calmodulin,CaM)作为Ca2+传感蛋白,介导了草莓叶片细胞ABA的下游信号事件.