一种基于电化学发光技术的高灵敏度PS-1基因点突变检测方法

电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)分析是20世纪90年代初发展起来的一种高灵敏度检测方法, 它将电化学法和化学发光法巧妙结合, 利用金属钌的复合物和三丙胺在电极表面发生氧化还原反应而产生高效、连续、稳定的发光, 具有灵敏、快速、准确、操作简便和分析适应性广等特点, 已被应用于核酸的定量分析之中. 将电化学发光技术应用于基因点突变检测, 采用了一种基于PCR技术和限制性内切酶技术的电化学发光分析方法检测Presenilin-1基因(简称PS-1基因)密码子235处发生的点突变. 结果显示, 在PCR循环次数相同的条件下, 野生型样品酶切前后的电化学发光信号强度基本保持不变; 突变型样品酶切前后的电化学发光信号强度变化显著. 该方法可明显区分野生型样品和突变型样品, 可望用于老年性痴呆病的早期诊断.     

3′碱基特异的PCR技术及β地中海贫血基因点突变的直接检测

PCR(聚合酶链反应)技术已广泛用于人类遗传病的基因诊断、临床医学、分子生物学、法医学及古生物学等各个领域的研究。在检测基因点突变时,通常采用PCR结合ASO(等位基因特异的寡核苷酸探针斑点杂交)或限制性内切酶酶解来判定。本文报道一个灵敏、     

我国大豆主产区黑龙江省田间种植大豆的转基因成分检测

采集黑龙江省不同地区田间210份大豆检测样品, 利用定性PCR技术分析检测其中是否含有转基因成分(CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS基因). 结果表明, 210份样品中均未检测到CaMV35S启动子成分; 在13个样品中虽扩增出类似CP4-EPSPS的条带, 但对PCR产物的进一步酶切鉴定表明, 所有扩增结果为假阳性. 利用巢式PCR对样品0x1的进一步分析表明, 该样品中不含有转基因大豆(roundup ready)成分. 对0x1样品用CP4-EPSPS引物扩增得到的片段进行了测序. 序列分析表明, 该片段与CP4-EPSPS基因的同源性仅有81%, 再次证明它不是转基因大豆的CP4-EPSPS基因.     

鸡生长激素基因单核苷酸多态与生长及屠体性状的相关性

以鸡生长激素(GH)基因作为控制鸡生长和屠体性状主基因的候选基因, 以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F₂代鸡群为实验材料, 通过PCR-RFLP方法对GH基因进行多态性检测. 在该基因内含子3中发现1处碱基突变: G →A, 由内切酶EcoR Ⅴ酶切证实; 在内含子4中发现1处碱基突变: C→T, 由内切酶MspⅠ酶切证实, 并由此对F₂代鸡群个体进行基因型鉴定. 方差分析结果显示, 在内含子3中的碱基突变与腹脂性状显著相关; 内含子4中的碱基突变与腹脂、胸肉屠体性状显著相关, 但两处突变与其他大部分生长和屠体性状相关不显著, 结果表明鸡GH基因可能是控制某些屠体性状的主基因, 或与控制这些性状的主基因紧密连锁.     

p53在肿瘤中的抑制和促进功能

什么是p53?现在认为p53基因在人类肿瘤发生过程中起着重要作用。野生型p53基因的功能是抑制异常细胞生长及向恶性状态发展。然而,一个点突变就可以使p53变成为细胞增殖和肿瘤发生的促进剂。本文将重点阐述有关p53基因对细胞增殖发挥功能效应的两个问题。首先,在正常细胞对生长刺激产生应答过程中野生型p53基因的抑制效应是如何被解除的?其次,野生型和突变型p53等位基因是如何发挥对细胞增殖抑制和促进这两个相对立的效应的?     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) nifA基因通过诱导宿主防卫反应调节根瘤的形成

苜蓿中华根瘤菌nifA基因是固氮基因的正调节因子, 本文研究了nifA基因对根瘤形成的调节作用. 在分裂根实验中, nifA突变株对另一侧根的结瘤抑制率比野生型菌下降43.7%, 感染突变株植物合成的植保素和形成的坏死细胞的数量也相应减少, 与植物防卫反应相关的苯丙氨酸解氨酶基因、查儿酮合成酶基因和几丁质酶基因不能表达. 这些结果说明, 苜蓿中华根瘤菌nifA基因通过诱导宿主植物的防卫反应对根瘤的形成进行调节. 虽然nifA突变株在宿主植物上引发根瘤的数量增加, 它合成的结瘤因子的量却比野生型菌株少. 因此, 可以推测nifA基因介导了多种信号途径对根瘤的形成进行调节.     

一种烟草突变型二磷酸核酮糖(RuBP)羧化酶/加氧酶的性质

烟草黄化突变型是 Nicotiana tabacum(var. John Wi11iams Broadleaf)的一种核突变体。在适中的光照条件及空气二氧化碳浓度下,这种黄色突变型的生长速度比野生型要缓慢得多。Zelitch曾报道:烟草黄色突变型的光呼吸作用比深绿色的野生型要高2至3倍,而突变型的净光合作用却比野生型的要低。RuBP羧化酶是光合作用及光呼吸过程中起关键作用的酶,其小亚基是由细胞核DNA所编码的。因此,阐明这种核基因突变是否影响到RuBP羧化酶的结构及性质将是重要而有趣的问题。     

杂色曲霉毒素体外对人胃细胞p53蛋白表达和DNA含量的影响

胃癌是常见的恶性肿瘤,其发病率具有明显的区域性.河北省赞皇县是胃癌高发区,胃癌年平均死亡率为59/10万,部分行政乡内可高达126.95/10万.我们以往研究显示,该地区胃癌高发与杂色曲霉及其毒素有关.p53是抑癌基因,该基因突变、丢失可导致细胞恶变,由于野生型p53蛋白产物半衰期短,只有6～20min,因此用免疫荧光和组化方法检测不到,而突变型的p53蛋白半衰期延长可达6h,所以检测到p53蛋白水平升高,则说明该基因发生了突变.目前发现很多致癌物     

果蝇无飞翔能力突变型6148的遗传及神经肌肉功能研究

行为遗传学一般的研究方法是先利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)诱发点突变,然后设计一种筛选装置,筛选所需要的行为突变型,得到所要的突变型后进行基因定位,再测定行为突变型在神经通路即感觉器官、神经系统及效应器官的什么部位、什么时间发生缺陷,以揭示突变基因与行为的关系。利用这种方法,Koana等人已筛选到果蝇X染色体上影响飞翔     

外源性p53基因对人胃癌细胞恶性增殖的影响

p53基因在细胞增殖调控过程中起重要作用,正常p53基因可使DNA受损的细胞增殖周期阻断在G1期以进行DNA修复,或启动细胞凋亡程序清除受损细胞,若p53基因缺失或突变,损伤后的细胞便会发生恶性增殖而形成肿瘤.约50%的人类肿瘤均有p53基因的异常改变.其中结直肠癌、肺癌、乳腺癌等常见肿瘤中p53基因的突变频率达50%～70%以上.基于这一原理,将野生型p53基因导入肿瘤细胞成为肿瘤基因治疗的策略之一.我国是胃癌高发区,胃癌发病率、死亡率在各类恶性肿瘤中均位居前列.因此,阐明胃癌发生发展过程中基因变异规律,探索胃癌治疗的有效方法,成为肿瘤研究的当务之急.研究表明胃癌中有较高频率p53基因缺失及突变,认为p53基因异常与胃癌发生、发展有重要关系.本项研究即是采用p53基因体外转染有缺陷的人胃癌细胞系,得到生长及致瘤性均有部分抑制的细胞,以探索采用p53基因治疗胃癌的可行性.1 材料与方法1.1 细胞培养及p53基因鉴定细胞:人胃癌BGC823细胞为北京医科大学附属人民医院建立,培养在含10%小牛血清的DMEM培养基中.染色体G带分析及荧光染色体原位杂交(FISH)显示有17号染色体部分缺失,Northern杂交分析也表明该细胞有p53基因表达水平下调.1.2 DNA转染通过脂质体介导将构建有野生型p53基因、突变型p53基因及无p5     

类DnaJ蛋白基因sll1384参与集胞藻PCC 6803的趋光反应

在集胞藻PCC 6803中, 基因sll1384编码的蛋白在N端含有一个DnaJ结构域, C端含有一个TPR结构域. sll1384突变株对不同温度的适应能力同野生型没有区别, 但其趋光运动能力几乎丧失. 将野生型sll1384基因导入突变株后, 可恢复其向光运动. 电子显微镜观察发现, 突变株细胞表面的纤毛与野生型没有明显区别. 突变株的转化效率也与野生型相同, 推测Sll1384通过与其他蛋白相互作用调节集胞藻的趋光反应. 这是在蓝藻中发现的第一个影响趋光反应的类DnaJ蛋白基因.     

磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)氢酶基因功能分析及对细胞生长的影响

探讨了磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1)氢代谢与细胞生长、磁小体合成之间的关系. 分别构建了吸氢酶大亚基基因hupL缺失突变株L206和氢酶大亚基基因hyaB与hupL的双缺失突变株B206. 比较了野生型菌株与突变株在摇瓶培养条件下的吸氢量、放氢量、细胞生长曲线和铁的吸收, 并结合电子显微镜观察了细胞内磁小体合成情况. 结果表明, 磁螺菌HupSL为专一性的吸氢酶, HyaAB为专一性的放氢酶; L206在磁小体合成过程中的放氢量相对较高, 其生长速度、铁吸收速度明显快于MSR-1及B206. 推测磁螺菌可通过上述吸氢酶和放氢酶的作用适当调节细胞内还原力的平衡, 促进铁的吸收和磁小体合成.     

植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD⁺-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶. 以拟南芥生态型“Columbia gl1”及甘蓝型油菜三系“陕2A”, “陕2B”和“垦C1”的叶片为材料, 采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD-IDH不同亚基基因. 同源性搜索发现, 来源于油菜的克隆基因是新基因. 将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点, 构建表达重组体, 均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白. 亚基0, 亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36 μg/mL的二硫键异构酶的体外翻译系统, 体外表达产物中检测到NAD-IDH酶活力. 不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明, NAD-IDH由3种亚基组成, 缺一不可, 缺少亚基0是致命的, 缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的. 同时发现, 来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象, 从而发生移框突变或无义突变, 使突变亚基不表现正常亚基1功能, 导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异.     

耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI缺陷性突变和功能补偿性突变株的建立

PprI是近来在耐辐射球菌Deinococcus radiodurans中发现的一个极其重要的DNA修复开关基 因. 以已测序的野生型菌株R1为材料, 运用PCR突变法将克隆具有自身GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段反向重组到pprI基因中去, 首次获得了卡那霉素抗性的、pprI功能完全破坏的突变株YR1. 辐射细胞生存率结果表明, YR1对辐射异常敏感. 另外, 将含有GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段重组到质粒pRADZ3中, 获得了具有卡那霉素抗性的表达质粒pRADK; 再将体外克隆的具有pprI完整基因和C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段分别重组到pRADK中. 研究结果表明, 含有pprI完整基因的表达质粒在YR1中能够正常表达, 并完全恢复到野生型的极端抗性; 而C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段虽能在YR1中正常表达, 但对辐射异常敏感, 不能恢复其极端抗性. 上述pprI基因功能缺陷性和功能补偿性突变株的建立, 为深入研究细胞体内PprI蛋白质的定位、结构域与功能的关系, 以及原位研究PprI蛋白质的理化特性提供了十分有效的方法     

用多聚酶链式反应快速检测转化细胞中外源人凝血因子重Ⅸ cDNA

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是利用人工合成的寡聚核苷酸引物和DNA多聚酶进行体外DNA扩增,这是近年迅速发展起来的分子生物学技术。这一技术已在基因诊断、突变检测、多态性研究和核苷酸顺序分析等方面得到应用。在基因转移和基因治疗中,常常有必要对转化细胞进行DNA分析,检测区分外源DNA和基因组DNA。常规用的方法不仅需要大量细胞,而且需要同位素标记的探针和Southern杂交,整个过程既麻烦又费时。本文介绍我们用PCR技术,对转有外源基因——人凝血因子IX cDNA的血友病B患者的原代皮肤成纤维细胞和其他转化细胞进行的直接检测和DNA分析。     

三丙二酸富勒烯对DNA限制性内切酶和Taq DNA聚合酶活性的抑制作用

采用具有HindⅢ和EcoRⅠ单一酶切位点的pEGFP-N1超螺旋型质粒为底物, 检测三丙二酸富勒烯(trimalonic acid C₆₀, TMA C₆₀)对DNA限制性酶切反应的作用. 同时以该质粒为模板, 测定TMA C₆₀对Taq DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的影响. 酶切产物与PCR扩增产物均通过琼脂糖凝胶电泳来显示. 实验发现, 在质粒酶切体系或PCR体系中添加TMA C₆₀后, 酶切或扩增产物的生成量均显著减少. TMA C₆₀的作用存在浓度依赖性, 对HindⅢ, EcoRⅠ两种酶切反应和PCR的半抑制浓度IC₅₀值分别为16.3, 6.0, 6.0 μmol/L. 两种活性氧清除剂L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁和叠氮化钠在浓度为2～10 mmol/L时, 不能拮抗TMA C₆₀对PCR和两种酶切反应的抑制作用. 但是, 在PCR体系中增加Taq DNA聚合酶能够拮抗TMA C₆₀的作用. 这些结果表明, TMA C₆₀能够抑制上述3种DNA代谢相关酶的活性, 其作用可能与活性氧无关.     

鼠伤寒沙门氏菌purB受purR调控的实验证据

通过遗传图和序列同源性分析获得了鼠伤寒沙门氏菌purB核苷酸序列。为揭示鼠伤寒沙门氏菌purB是否受purR调控,对purB基因的PUR box进行了功能分析。PCR扩增野生型PUR box和其第14位保守碱基发生突变（C→T）的DNA片段。分别与从鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株LT2提取的P urR粗制品进行了凝胶阻滞实验。结果表明,purB基因的PURbox与PurR阻遏蛋白有很好的结合能力,而突变的PUR box则不能与PurR阻遏蛋白结合。可见,野生型鼠伤寒沙门氏菌purB与嘌呤从头合成途径中其他结构基因一样是受purR基因协同调控的。此外还对不受调控的实验现象的机制做了研究。结果表明purB组成型表达是purB::MudJ基因融合发生在PUR box上游（－554bp)的结果。这一结果还为鼠伤寒沙门氏菌purB基因与其上游ycfC基因属于同一操纵子提供了有力的证据。     

细胞色素b5若干表面荷负电残基突变体蛋白的制备及初步表征

用寡聚核苷酸诱导定点突变方法,将细胞色素b5血红素暴露边周围的负电荷残基用疏水性丙氨酸残基取代,得到7种双方和多点突变的细胞色素 b5蛋白,基因碱基序列测定以及蛋白质分子量测定结果都表明突变正确,突变体蛋白的光谱电化学研究结果表明,它们的表观还原电位发生了2－10mV的正向移动,突变体蛋白的整体结构没有明显变化,为进一步研究蛋白表面电荷的作用奠定了基础。     

具有广泛寄主范围转移特性的Tn5-nifA重组质粒的构建

固氮作用调节的研究指出固氮基因(nif基因)受氨和氧的阻遏.近几年来,已有报道基因nifA产物引起氨存在下固氮酶合成的去阻遏作用.1983年,Zhu等构建了一个带有nifA的重组质粒pST1021引入野生型和gln突变型的肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae),两者在氨存在下都发生固氮酶合成的去阻遏作用.当pST1021引入具有固     

转pMThGH基因红鲤F4代鱼体内转植基因存在的分子多态性

从一尾转ｐＭＴｈＧＨ基因红鲤Ｆ４代仔鱼基因组内回收并克隆了５０个转植基因（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）,对其中３３个进行分析。根据双酶切结果,可将这此回收基因分为４种类型。用５种内切酶构建了这４种类型回收基因的限制性内切酶图谱,第１种类型（６个,占１８％）与建立原代基因鱼所用的外源基因相同,而其他３种类型回收基因的分子量大小、切位点的种类、数量、位置都迥异于转移前的结构,意味着大多数转植基因顺序发生了缺失