抗尖吻蝮蛇毒卵黄抗体口服给药保护剂的研究

【目的】比较硫糖铝和5种糖类对抗尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)毒卵黄抗体(IgY)的保护作用,为开发抗尖吻蝮蛇毒IgY口服制剂提供依据。【方法】通过免疫白来航鸡(Gallus domesticus),从所产鸡蛋中制备抗尖吻蝮蛇毒IgY。在不同pH 值(2.0,3.0)条件下,于IgY中加入相同剂量的保护剂,用ELISA 法测定IgY 活性;在pH 值为2.0且加入条件下,加入等于或高于胃内正常质量浓度的胃蛋白酶,后加入不同剂量的硫糖铝,再用ELISA法测定IgY 抗体活性;用不同剂量的保护剂与IgY混合后灌胃小鼠(Mus musculus),在不同时间点(1.5,2.5,3.5h)取血,采用ELISA和Western法测定血清中的IgY活性。【结果】在pH 值为2.0和3.0条件下,硫糖铝对IgY抗体活性的保护效果均为最佳;在pH 值为2.0且加入不小于胃内正常的胃蛋白酶质量浓度的条件下,体积分数在30%以上的硫糖铝均可提高IgY 活性;IgY 灌胃后的小鼠血清中,体积分数为50%的硫糖铝可有效保护IgY 活性。【结论】加入硫糖铝作保护剂后能有效提高IgY 对胃酸和胃蛋白酶的抵御作用。
     

石柑子水提物对尖吻蝮蛇毒活性抑制作用的初步研究

【目的】寻找用于治疗尖吻蝮(Agkistrodon acutus)咬伤的中草药石柑子(Pothos chinensis)的药效实验证据。【方法】将制备所得石柑子水提物与尖吻蝮蛇毒混合孵育40min,检测混合液中蛇毒的磷脂酶A2活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、出血活性、凝血活性和致死活性。【结果】石柑子水提物对尖吻蝮蛇毒的磷脂酶A2活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、出血活性、凝血活性和致死活性都有明显抑制作用。【结论】研究结果初步证实了石柑子对尖吻蝮咬伤具有治疗效果。     

尖吻蝮蛇毒对人卵巢癌A278O细胞的抑制作用研究

【目的】研究尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒对人卵巢癌A2780细胞(后简称A2780细胞)形态学特征、细胞增殖活力及粘附能力的影响。【方法】采用倒置荧光显微镜观察在不同质量浓度和时间条件下,尖吻蝮蛇毒对A2780细胞形态学特征的影响;采用CCK-8法检测细胞增殖率的变化,使用细胞计数法检测尖吻蝮蛇毒对细胞粘附能力的影响。【结果】当尖吻蝮蛇毒质量浓度为3.125μg·mL-1时,A2780细胞出现少量皱缩、变圆、凋亡的现象;随着尖吻蝮蛇毒质量浓度增加,细胞凋亡的现象愈加明显。当用50μg·mL-1的尖吻蝮蛇毒处理A2780细胞1h后,被处理细胞出现少量皱缩、变圆现象;12h后,被处理细胞粘连成团,出现大量凋亡现象。在3.125～200μg·mL-1范围内,随着尖吻蝮蛇毒质量浓度的增加,A2780细胞增殖活力逐渐减弱,且呈明显剂量依赖关系。当用3.125μg·mL-1的尖吻蝮蛇毒处理A2780细胞时,细胞粘附率降为78.26%;当蛇毒质量浓度为25μg·mL-1时,细胞粘附率降为不足10%。【结论】尖吻蝮蛇毒可明显影响A2780细胞的形态学特征,抑制该细胞的增殖活力以及粘附能力。     

石柑子水提物对尖吻蝮蛇毒活性抑制作用的初步研究

【目的】寻找用于治疗尖吻蝮(Agkistrodon acutus)咬伤的中草药石柑子(Pothos chinensis)的药效实验证据。【方法】将制备所得石柑子水提物与尖吻蝮蛇毒混合孵育40min,检测混合液中蛇毒的磷脂酶 A2 活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、出血活性、凝血活性和致死活性。【结果】石柑子水提物对尖吻蝮蛇毒的磷脂酶 A2 活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、出血活性、凝血活性和致死活性都有明显抑制作用。【结论】研究结果初步证实了石柑子对尖吻蝮咬伤具有治疗效果。
     

小叶三点金不同萃取相对尖吻蝮蛇毒主要酶类的抑制作用

【目的】考察小叶三点金(Desmodium microphyllum)乙醇提取物不同萃取相对尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)毒主要酶类的抑制作用。【方法】采用不同极性溶剂对小叶三点金乙醇提取物进行萃取,检测各萃取相对尖吻蝮蛇毒中蛋白水解酶、磷脂酶A2、透明质酸酶和类凝血酶的抑制作用,再结合气相色谱-质谱法(GC-MS)对抑制作用最强的萃取相进行组分分析。【结果】乙酸乙酯萃取相能够明显抑制尖吻蝮蛇毒中的蛋白水解酶、磷脂酶A2和透明质酸酶和类凝血酶的活性,经GC-MS分析检测出26种成分,其中正十六烷酸、十八碳烯酸、豆甾醇和谷甾醇具有抑制蛇毒活性的作用。【结论】小叶三点金醇提物乙酸乙酯萃取相对尖吻蝮蛇毒中主要酶类具有明显抑制作用,能够作为有效部位用于抗蛇毒功效组分的筛选研究。
     

黑老虎醇提物对尖吻蝮蛇毒主要酶类的抑制作用

【目的】探究中草药黑老虎(Kadsura coccinea)醇提物对尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒中主要酶类的抑制作用。【方法】用体积分数为75%的乙醇溶液浸泡黑老虎后再进行超声波处理得到醇提物；通过体外酶活抑制实验分别检测醇提物对尖吻蝮蛇毒中磷脂酶A2、蛋白水解酶、透明质酸酶、类凝血酶的抑制作用。【结果】黑老虎醇提物对尖吻蝮蛇毒中的蛋白水解酶、磷脂酶A2和透明质酸酶具有明显的抑制作用。当蛇毒与醇提物的质量比分别为1∶100，1∶10和 1∶5时，后者能抑制蛇毒中98%磷脂酶A2活性、79%蛋白水解酶活性和65.14%透明质酸酶活性。同时，醇提物能够明显抑制尖吻蝮蛇毒水解纤维蛋白原和类凝血酶的活性。【结论】研究结果证实了黑老虎醇提物能有效抑制尖吻蝮蛇毒中的主要酶类，为深入研究黑老虎药材的抗蛇毒机制提供了理论依据。     

蛇莓乙醇提取物抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性初探

【目的】初步探究蛇莓(Duchesnea indica)对尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒蛋白水解酶的抑制作用。【方法】采用不同极性有机溶剂对蛇莓乙醇提取物进行分级萃取,结合硅胶薄层层析(TLC)进行分离,再利用气相色谱-质谱法(GCMS)对抑制蛋白水解酶作用最强的活性部位进行组分分析。【结果】乙酸乙酯萃取相具有较强的抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性;经硅胶TLC分离从中获得条带1、条带2、条带3和条带4共4个条带,且条带4的尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶抑制活性最强。通过GC-MS分析检测出条带4中存在15种成分,其中2,4-二叔丁基苯酚、正十六烷酸、十八烷酸、十六烷酸,2-羟基-1-(羟甲基)乙酯、硬脂酸-2-羟基-1-(羟甲基)乙酯和10,13-十八碳二炔酸甲酯可能与抑制蛇毒活性相关。【结论】蛇莓中存在抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶的功效组分,可以作为蛇伤药物开发的资源。     

尖吻蝮蛇毒不同蛋白酶水解物的制备及抗氧化活性研究

【目的】研究尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒的不同蛋白酶水解产物的制备及抗氧化活性。【方法】分别用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解尖吻蝮蛇毒,以水解物的水解度、清除自由基活性、金属离子螯合能力和总还原力作为抗氧化活性比较指标来选出最佳水解蛋白酶,并比较该蛋白酶水解物在超滤后得到的不同分子量组分的抗氧化活性大小。【结果】碱性蛋白酶水解物的清除DPPH自由基活性、亚铁离子螯合能力和总还原力均为最佳;该酶解物经超滤得到的3个组分中,分子量为3～10kDa的组分对DPPH自由基和羟基自由基清除能力最强,分子量大于10kDa的组分的亚铁离子螯合能力和总还原力最强。【结论】尖吻蝮蛇毒的不同蛋白酶水解物均具有抗氧化活性,其中用碱性蛋白酶水解物抗氧化活性较强。     

北部湾金黄水母Chrysaora helvola Brandt刺细胞毒液溶血活性

【目的】探讨金黄水母Chrysaora helvolaBrandt刺细胞毒液(nematocysts venom,NV)的红细胞溶血活性特征及可能机制。【方法】通过分光光度法测定红细胞溶解释放血红蛋白的量来确认不同条件和药物对NV诱导红细胞溶血行为的影响。【结果】NV诱导的红细胞溶血与其总蛋白浓度存在依赖关系。溶液pH值、大分子非电解质渗透压保护剂PEGs均能显著影响其溶血活性;非电解质小分子糖类渗透压保护剂D-甘油和D-半乳糖对溶血活性影响很小,但D-葡萄糖能显著延缓溶血。NV同时具有Ca~(2+)依赖的弱磷酸酯酶A2(PLA_2)活性,且受组氨酸烷基化试剂p-BPB抑制。这一PLA2活性可能对其红细胞溶血活性也有贡献。【结论】NV的红细胞溶血活性可能由膜穿孔机制和所含PLA_2酶成分造成,并受到含葡萄糖单元结构的糖受体调节。     

海洋热带假丝酵母产角鲨烯发酵工艺研究

【目的】为了从海洋热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株中获取高产量的角鲨烯活性物质。【方法】研究不同碳源、氮源、培养温度、培养基初始pH值、培养时间、光照和氧气等条件对海洋热带假丝酵母菌株产角鲨烯的影响。【结果】确定最优培养基为(W/V)1%酵母膏+2%蛋白胨+2%蔗糖,最佳摇瓶发酵条件:有氧条件下,初始pH值为5.0,培养温度25℃,经48h培养,角鲨烯产量可达2.25mg/g干重。【结论】采用优化后工艺条件进行发酵,获得的角鲨烯产量明显提高。     

重组草酸青霉生淀粉糖化酶的酶学特性鉴定

【目的】了解在毕赤酵母中表达的来源于草酸青霉(Penicillium oxalicum)GXU20的重组生淀粉糖化酶的酶学特性。【方法】用3,5-二硝基水杨酸法测定pH值、温度、金属离子和化学试剂对纯化的重组生淀粉糖化酶的活力的影响,同时测定酶的底物特异性、酶对生淀粉的吸附能力以及酶对不同生淀粉的水解效率等,用高效液相色谱法对该酶水解生木薯淀粉的产物进行分析鉴定,用扫描电子显微镜观察重组酶对不同生淀粉颗粒的水解方式。【结果】重组生淀粉糖化酶rPoGA15A的最适pH值为4.5,最适温度为65℃,在pH值为2.0~10.0时,重组酶具有较好的pH耐受性,温度小于50℃时,酶的稳定性好。除Ag~+、Cu~(2+)和SDS之外,其他大部分金属离子和化学试剂对重组酶的酶活力影响不大。重组生淀粉糖化酶对大米和玉米生淀粉的活性较高,对木薯和马铃薯生淀粉的活性次之,重组生淀粉糖化酶rPoGA15A对不同生淀粉的吸附能力与其对相应不同生淀粉的水解活性大小呈正相关。扫描电子显微镜观察表明重组生淀粉糖化酶对不同生淀粉颗粒的降解作用明显,水解方式各有特点。高效液相色谱分析表明该重组生淀粉糖化酶水解生木薯淀粉的产物仅有葡萄糖。重组生淀粉糖化酶rPoGA15A在40℃下对大米和玉米生淀粉水解72h后水解率分别达到86.5%和71.9%。【结论】重组生淀粉糖化酶具有广泛的pH耐受性,对生淀粉具有高水解活性,在生淀粉的水解和生料同步糖化发酵生产酒精中有一定的应用潜力。     

尖吻蝮蛇三种毒蛋白氨基酸组成与N—末端分析

尖吻蝮蛇(Agkistrodon Acutus)三种毒蛋白的纯化及其性质的研究,徐洵等已经作详尽报道,它们都具有出血及致死作用,并兼有蛋白水解酶活性和纤溶活性等多种功能。但其出血活性不尽相同,如AaT—Ⅰ出血活性最大,还兼有肌溶作用,AaT—Ⅱ出血活性次之,而对心肌则有明显毒性作用,AaT—Ⅲ出血活性较小,主要为肌肉坏死作用。因此,研究这些毒蛋白的结构和功能的关系具有一定的理论和实践价值。分析比较它们在结构上的微观异     

酶法提取方格星虫多糖的条件及优化

【目的】确定胰蛋白酶酶解法提取方格星虫(Sipunculus nudus)体壁中水溶性多糖的最优条件。【方法】分别从料液比、浸提温度、浸提时间、浸提pH值、酶底比等5个方面进行了初步研究。研究分为两部分进行,先确认提取方法中各单因素的最优条件,再根据单因素试验结果选取4个主要因素(料液比、浸提温度、浸提pH值、酶底比),进行四因素三水平的正交试验,得到方格星虫水溶性多糖水提法的最佳组合。【结果】正交试验结果表明:对方格星虫多糖提取率影响最大的为浸提温度,其次是pH值和料液比,影响最小的为酶底比。最佳浸提条件为:温度60℃、pH值8.0、料液比1∶12g·mL-1、酶底比为2.0%、时间3h。【结论】在最优浸提条件下,方格星虫水溶性多糖酶提法所得的最佳提取率为1.59%。此方法高效稳定可行,能有效提高方格星虫的多糖提取率。     

卵源性多价抗蝮蛇毒IgY的制备及检测

采用短尾蝮(Gloydius brevicaudus)、乌苏里蝮(Gloydius ussuriensis)、岩栖蝮(Gloydius saxatilis)、原矛头蝮(Protobothrops mucrosquamatus)和菜花原矛头蝮(Protobothrops jerdonii)5种蛇毒的混合物制备类毒素,免疫20~22周龄莱航母鸡并收集鸡卵,用冻融法、水稀释法和PEG法提取卵黄多价抗蝮蛇毒IgY,并用酶联免疫法和蛋白印迹法对所得IgY效价进行检测.结果表明:母鸡在免疫期间产下的鸡卵中,均存在可有效中和上述5种蛇毒的卵黄抗体IgY,且诱导量随免疫强度的提高而增加;不同方法所得有效抗体的含量存在一定差异,且同一提取法所得抗体对不同蛇毒的交叉中和能力也不同,这可能与动物对5种蛇毒的免疫应答存在差异有关.     

解淀粉芽孢杆菌HZM9菌株发酵液的抑菌谱及稳定性测定

【目的】将前期分离到的1株具有高效植物促生作用和生物防治作用的解淀粉芽孢杆菌HZM9开发为可以进行田间应用的菌剂。【方法】首先以10种土传病害病原菌为指示菌,用生长速率法测定了HZM9菌株发酵液对各病菌的抑制作用; 又以榉树枯萎尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为指示菌,测定了发酵液在不同条件下的稳定性。【结果】供试的10种土传病害病原菌经菌株HZM9发酵液处理后,菌丝生长均受到明显的抑制,特别是对尖孢镰刀菌和大豆菌核(Sclerotinia sclerotiorum)的抑菌率均达90%左右。菌株HZM9发酵液有很好的热稳定性,温度升至80 ℃后其抑菌作用变化十分微弱,抑菌率仍然保持在80%以上; 100 ℃处理30 min抑菌率会下降到66.55%,100 ℃处理120 min,抑菌率仍能达到58.78%; 在普通光照和紫外线照射后可以保持稳定的抑菌活性,在pH 5～9和蛋白酶的处理后抗菌活性也很稳定; 在4 ℃下可以持续储藏150 d。【结论】HZM9具有广谱抑菌活性和很好的稳定性,能够适用于土传病害的生物防治。     

超声波协同酶法提取菝葜中总黄酮工艺参数优化

【目的】为开发菝葜(Smilax china)资源提供理论和实践依据。【方法】采用超声波辅助酶法提取菝葜中总黄酮,通过单因素试验考察酶用量、pH值、酶解时间和酶解温度对菝葜中黄酮得率的影响。在此基础上,再利用响应面法优化提取条件,研究pH值、酶解时间和酶解温度3个自变量之间的交互作用对黄酮得率的影响。【结果】最佳提取工艺条件为pH值5.10,酶解时间48 min,酶解温度为53℃,在此条件下总黄酮得率达到2.289%。【结论】该优化工艺合理可行,可用于菝葜中总黄酮的提取。     

油梨不同部位总酚含量、抗氧化及抗菌活性

【目的】研究油梨(Persea americana Mill.)不同部位(果皮、果肉、果核、叶子)50%(V/V)甲醇提取物的总酚含量、抗氧化及抗菌活性,并分析总酚含量和抗氧化活性间的相关性。【方法】采用福林酚(Folin-Ciocaltea)法测定总酚含量,DPPH·(1,1-二苯基-2-苦肼基)自由基清除法测定抗氧化活性,SPSS 19.0双变量相关分析法分析总酚含量与抗氧化活性间的相关性,纸片法测定抗菌活性。【结果】油梨果皮的总酚含量最高,果核和叶子次之,果肉的最低。果皮、果核和叶子均具有较强的清除DPPH·自由基的能力,果肉的则相对较弱。4个部位清除DPPH·自由基能力与其所含的总酚含量存在显著的正相关关系,相关系数r值达0.983,即抗氧化能力随总酚含量的增加而增强。油梨皮和核部位对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有抗菌作用,但对白色念珠菌(Candida albicans)没有抑菌作用。【结论】油梨具有较强的抗氧化活性和一定的抗菌活性,为更好地综合开发和利用油梨提供理论依据。     

亚硝酸盐胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶活性的影响

目的:分析不同质量浓度亚硝酸盐急性胁迫对尖吻鲈稚鱼(Lates calcarifer)(15日龄)消化酶活性的影响.方法:采用半静水生物测试法,以自然海水(亚硝酸盐质量浓度小于0.03 mg/L)为对照组,开展质量浓度分别为67、200和333 mg/L亚硝酸盐对尖吻鲈稚鱼的急性胁迫实验,分析0、6、12、24、36、48、72和96 h实验鱼消化道中胃蛋白酶、脂肪酶以及淀粉酶活性.结果:不同处理组个体消化酶活性有统计学差异(P0.05).低、中质量浓度(67、200 mg/L)处理组个体胃蛋白酶活性随时间的变化而呈双波峰变化趋势,高质量浓度(333 mg/L)处理组,个体胃蛋白酶活性先下降后上升;个体脂肪酶活性均因亚硝酸盐的处理而呈波动趋势;个体淀粉酶活性随处理质量浓度升高分别呈"U"型、双波谷和不规则波动趋势,且均显著低于对照组.结论:消化酶活性在亚硝酸盐刺激下具有调节反应.     

尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化

将尖吻蝮蛇类凝血酶基因克隆到载体pET32a(+)上,在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达N端融合了硫氧还原蛋白的类凝血酶.通过SDS-PAGE检测融合蛋白条带,纤维蛋白原凝结实验检测酶学活性.确定表达菌株后,对其诱导条件进行优化,在30℃诱导3 h,诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol·L-1条件下类凝血酶表达水平最高.     

濒危药材红芽大戟组培快繁影响因素研究

【目的】研究濒危药材红芽大戟(Knoxia corym bosa Willd)最适宜的组培快繁方法,为规模化生产红芽大戟提供依据。【方法】选取红芽大戟不同组织器官为外植体,采用不同配方的培养基培养,研究影响外植体诱导分化、增殖和生根的因素,筛选获得最佳培养基。【结果】外植体采用茎尖优于叶轴、叶片,茎尖接种于MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA,萌芽率为100%,MS+3.0mg/L 6-BA+0.30mg/L NAA最适用于继代增殖培养,1/2MS+2.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA最合适生根培养。【结论】选取合适的外植体,采用适宜的培养条件和培养基,可以有效地进行红芽大戟的组培快繁。