日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

拟穴青蟹凝集素基因Splec1的克隆及原核表达载体的构建

为获得高表达拟穴青蟹(Scyiia paramamosain)凝集素(Lectin) Splec1的工程菌,本实验根据GenBank中凝集素的基因序列,设计合成1对扩增Splec1基因完整ORF的特异性引物,采用RT-PCR技术从拟穴青蟹血液中分离扩增了Splec1的eDNA序列(495 bp),将该基因重组到原核表达载体pET32a(+)中,酶切和测序分析表明,重组质粒pET32a(+)-Splec1结构正确.     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.     

南方鲇(Silurus meridionalis)神经肽Y基因cDNA克隆及组织表达分析

以南方鲇(Silurus meridionalis)为对象,运用RT-PCR和RACE技术,获得神经肽Y(Neuropeptide Ty-rosing,NPY)基因cDNA的全序列.该基因cDNA全长743bp,包括3′非编码区(UTR)373bp,5′非编码区(UTR)82bp,开放阅读框(ORF)288bp,编码95个氨基酸.与其他脊椎动物进行同源性分析发现,南方鲇NPY序列与斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的同源性最高,达79%,其次为瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii),同源性达76%.进化树分析也表明,南方鲇与斑点叉尾鮰和瓦氏黄颡鱼聚为一支.qPCR显示,南方鲇NPY mRNA在脑、心脏、肾脏、鳃、胃、肠和肝等7种组织中都有不同程度的表达,其中在脑中的表达量最高.     

人补体调节蛋白基因MCP和DAF的克隆及其在E. coli中的表达

人膜辅基蛋白MCP(membrane cofactor protein)和降解加速因子DAF(decay-accelerating factor)是免疫排斥反应中补体系统活性调节的重要蛋白．以PCR的方法分别从成人肝cDNA文库和胎儿骨髓cDNA文库中扩增得到MCP和DAF基因，克隆入载体pUC19，再以所构建质粒为模板，以PCR的方式在二基因间加入编码柔性连接肽的DNA序列，构建融合基因MCP-DAF，并克隆入pUCl9质粒．将MCP、DAF及MCP-DAF亚克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a( )或pET-32b( )，构建表达载体MCP-pET32a，DAF-pET32b及MCP-DAF-pET32a，分别导入E．coli BL21菌株中表达，得到预期分子质量大小的蛋白．     

毛冠鹿AIF-1原核载体的构建及表达

从毛冠鹿睾丸cDNA文库中筛选出毛冠鹿AIF-1基因,对其进行生物信息学分析,设计引物克隆毛冠鹿AIF-1 cDNA,连入pMD19-T载体,测序正确后酶切,与表达载体pET-28a(+)连接,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,并对可溶性蛋白进行纯化,SDSPAGE电泳,Western Blot分析以及鉴定重组蛋白.结果表明,毛冠鹿AIF-1(TdAIF-1)含有1个438bp的开放阅读框,编码145个氨基酸,经测序和酶切鉴定后,成功构建重组质粒pET-28a(+)-TdAIF-1,表达大小约20 kD的重组蛋白,主要以可溶形式存在,提高洗脱缓冲液中咪唑浓度至50 mmol/L、100 mmol/L能够得到较纯的蛋白.成功构建毛冠鹿AIF-1原核表达体系,获得重组蛋白,为研究AIF-1蛋白的生物学功能奠定了基础.     

海甘蓝硫甙合成关键酶S—GT基因两种表达载体的构建

Thiohydroximate S-glucosyltransferase(S-GT)是硫甙生物合成的一个关键酶.根据发表的甘蓝型油菜S-GT基因cDNA序列设计引物,以海甘蓝总DNA为模板进行PCR扩增,获得S-GT基因全长,构建了海甘蓝S-GT基因的植物双元表达载体pCambia2300sn-CaSGT.用PCR的方法对CaSGT基因的外显子进行了拼接,将得到的序列正向插入到了大肠杆菌表达载体pET-32b(+)中,得到重组质粒pET·32b(+)-CaS-GT,为进一步研究CaSGT的生物学特性打下基础.     

水稻基因ST1的克隆及原核表达

指出了基因ST1是决定水稻柱头和花柱形成的关键基因,属于水稻中的XHS基因家族.将ST1的全长cDNA序列构建到原核表达载体pET-28a中,并转化了表达菌株大肠杆菌BL21.经Western bolt验证表明:所表达80 kD蛋白即为目的蛋白,为后续的蛋白功能等研究提供了实验基础.     

停乳链球菌ISP基因的克隆与表达及其免疫原性研究

根据GenBank报道的停乳链球菌免疫分泌蛋白基因(immunogenic secreted protein,ISP)序列设计引物,PCR扩增得到1 550bp的isp片段,其基因序列与GenBank提交序列的同源性为98.13%.将isp基因与表达载体pET-25b(+)连接,成功构建重组质粒pET-25b(+)-isp.转化大肠杆菌BL21(DE3),成功得到阳性表达重组菌株BL21(pET-25b(+)-isp).经IPTG诱导后,SDS-PAGE与Western blot检测得到约55ku的目的蛋白.经优化确定,isp蛋白的最优表达条件:1mmol/L IPTG,37℃诱导18h,且此时表达的蛋白具有良好的抗原性.该研究制备了奶牛乳房炎停乳链球菌的基因工程疫苗,并对其免疫原性进行了探究,为奶牛乳房炎的免疫防治奠定了基础.     

牛ANGPTL1基因的电子克隆与序列分析

以牛的ANGPTL1基因为研究对象,利用生物信息学方法,对牛的ANGPTL1基因进行了电子克隆和序列分析,并对推导出的ANGPTL1蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛的ANGPTL1基因序列长为2576bp,该基因的编码序列长为1476bp,编码492个氨基酸,编码序列的两翼有135bp的5’非编码区和785bp的3’非编码区。DNA序列的G＋C百分含量为44．31％,A＋T百分含量为55．69％。该基因的核苷酸序列与人、黑猩猩、鼠和狗ANGPTL1基因的cDNA序列的相似性分别为91％、90％、82％和93％。在氨基酸序列上与人、黑猩猩、鼠和狗的相似性分别为95％、95％、92％和95％。用氨基酸序列构建的进化树显示,在人、牛、黑猩猩、狗、褐鼠、原鸡几种动物中,牛与狗的亲缘关系最近。     

异色瓢虫的HSP 90基因的克隆与特性分析

 采用同源克隆和锚定PCR技术, 从异色瓢虫 Harmonia axyridis (Pallas)中克隆到热休克蛋白HSP 90 基因的cDNA全序列（Genbank number: FJ501962）。cDNA全长2 480 bp,包含3′非编码区域(UTR)为200 bp和5′UTR为126 bp,开放阅读框(ORF) 长2.154 bp,编码717个氨基酸。预测的相对分子质量为82.230, 理论等电点为4.96,无糖基化位点、跨膜结构和信号肽。在N端具有 HSP 90 基因保守的ATPase结构,含有HSP90家族的C末端的保守序列EEVD。与赤拟谷盗 Tribolium castaneum 相比较,同源性高达90%,系统发育分析也表明两者的亲缘关系最近。 HaaHSP 90 基因的克隆和比较分析为进一步深入研究异色瓢虫的抗逆机理及其进化具有重要意义。     

油菜MAP激酶基因BnMPK6基因的克隆及表达分析

从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAP激酶基因BnMPK6,全长1521 bp,其中包括1185 bp的开放阅读框,81 bp的5′非翻译区(5′UTR),255 bp的3′非翻译区(3′UTR).与拟南芥AtMPK6同源性达86.9%,因此命名为BnMPK6(GenBank登录号为HQ156228).该基因编码394个氨基酸的蛋白质,分子量44.8 kDa,等电点为5.13.实时荧光定量PCR结果表明该基因表达量随着低温胁迫时间的增长而增高,说明BnMPK6基因受低温胁迫诱导表达.     

斑马鱼cGnRH-Ⅱ的基因克隆与序列分析

从斑马鱼脑组织提取总RNA,应用RT--PCR方法克隆eGnRH cDNA,其长度为646bp,包括一个258bp开放阅读框;编码的cGnRH-Ⅱ前体为86个氨基酸残基,由一个信号肽、GnRH十肽和一个由蛋白水解位点（Gly—Lys—Arg）连接的促性腺激素释放激素相关肽（GAP）组成;其中信号肽和联接肽的长度分别为24和49个氨基酸．该eDNA编码的cGnRH-Ⅱ的前体氨基酸序列与其他物种的cGnRH-Ⅱ前体一致．表明物种问cGnRH—Ⅱ cDNA的蛋白编码区高度保守,而非编码区的保守性程度很低．进化分析表明,斑马鱼与鲤鱼、鲫鱼、拟鲤、黑头软口鲦等淡水的鲤科鱼类的同源性较高．     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

异色瓢虫的HSP90基因的克隆与特性分析

采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫Harmonia axyridis(Pallas)中克隆到热休克蛋白HSP90基因的cDNA全序列(Genbank number:FJ501962)。cDNA全长2 480 bp,包含3′非编码区域(UTR)为200 bp和5′UTR为126 bp,开放阅读框(ORF)长2 154 bp,编码717个氨基酸。预测的相对分子质量为82 230,理论等电点为4.96,无糖基化位点、跨膜结构和信号肽。在N端具有HSP90基因保守的ATPase结构,含有HSP90家族的C末端的保守序列EEVD。与赤拟谷盗Tribolium castaneum相比较,同源性高达90%,系统发育分析也表明两者的亲缘关系最近。HaaHSP90基因的克隆和比较分析为进一步深入研究异色瓢虫的抗逆机理及其进化具有重要意义。     

猪色素上皮衍生因子的电子克隆及序列分析

用鼠的色素上皮衍生因子cDNA序列在猪的ESTs库进行BLASTn搜索,得到一系列不同大小的ESTs片段,经拼接得到完整cDNA序列.序列分析显示该cDNA长1 425 bp,有一个1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,5’非编码区长53 bp,3’非编码区长130 bp,有一个加尾序列和多聚腺苷酸尾巴.其核苷酸序列与牛、人和鼠的同源性分别为89%、87%和82%,氨基酸的同源性分别为89%、87%和84%,且有保守的糖基化位点、半胱氨酸位点和serp in基序,说明所克隆的cDNA序列为猪的PEDF全长cDNA.     

费尔干猪毛菜液泡膜氢离子焦磷酸酶基因SfVP的克隆、序列分析及表达

植物液泡膜氢离子焦磷酸酶(Vacuolar H+-PPase,VP)能够酸化液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在植物耐盐性方面发挥着着重要作用。本研究采用RT-PCR结合RACE方法,从费尔干猪毛菜中(Salsola ferganica)克隆得到液泡膜质子焦磷酸酶基因SfVP,该基因的cDNA全长2738 bp,包含1个2301 bp的完整开放读码框(ORF),编码766个氨基酸的多肽。氨基酸序列分析表明其属于H+-转运无机焦磷酸酶超家族成员,具有典型的H+-PPase结构域,其疏水性较强,含有12个跨膜螺旋结构。SfVP序列比对显示具有H+-PPase的3个保守序列CS1、CS2和CS3,其中CS1中含有保守的底物催化位点,与烟草的NtVP氨基酸序列相似性为95.3%。半定量RT-PCR结果表明,SfVP的转录表达丰度随着600 mmol/L NaCl处理时间的增加而升高,处理12 h后显著增加并一直维持在较高水平。     

Molecular characterization of a K+ channel blocker in the scorpionButhus martensii Karsch

K⁺ channel blockers of scorpion venoms are of important value in studying pharmacology and physiology of specific K⁺ channel of cells. Based on the amino acid sequences of BmP01 previously characterized as a small-conductance Ca²⁺-activated K⁺ channel blocker, two “back to back” degenarate primers have been designed and synthesized for inverse PCR strategy, its full-length cDNA has been cloned from the venom gland of the Chinese scorpionButhus martensii. The cDNA is composed of 3 parts: 5′ UTR, ORF and 3′ UTR. The flanking sequence of translation initiation codon ATG is AAAATGA, which is highly conserved in scorpion Na⁺ channel toxin and protozoan genes, suggesting that these genes may have followed a common mechanism for translation initiation. The 3′ UTR contains poly(A) signal AATAAA. The open reading frame encodes a precursor of 57 residues with a signal peptide of 28 residues and a mature peptide of 29 residues. The signal peptide is rich in hydrophobic amino acid residues and its length is significantly different from that of the determined scorpion Na⁺ channel toxin. The deduced amino acid sequence of mature peptide is completely consistent with BmP01 previously determined by primary structure analysis.