丙烯酰CoA合成酶在大肠杆菌中的表达及其酶活性表征

以橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus）dsm636基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆了丙烯酰CoA合成酶（ACS）基因,并连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建了pET-22b(+)-Acs重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+) Acs转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建了大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-Acs基因工程菌。重组菌株经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,目标条带出现在分子量约160000处,表明丙烯酰CoA合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达;体外酶活实验证明,所表达的丙烯酰CoA合成酶是具有活性的。     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的表达与纯化

根据GenBank报道的PRRSV VR2332基因序列设计引物,经RT - PCR扩增,得到大小约为390 bp的阳性产物;利用Bam H Ⅰ,EcoR Ⅰ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE,Western blot分析.结果表明:克隆的N蛋白基因与GenBank报道的VR2332基因同源性为93.83％;重组菌株经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;经筛选得到最佳诱导条件,即1 mmol/L IPTG诱导6h,蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635％,SDS-PAGE后切胶回收可得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础.     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

花生过敏原Ara h2.02的克隆、表达及免疫学鉴定

通过提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h2.02基因,将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序,将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中,IPTG诱导表达、Western-blotting检测该重组蛋白的免疫原性.测序结果表明:克隆的花生Ara h2.02基因片段全长为519 bp,编码为172个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同.诱导表达后的蛋白经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western-blotting结果表明该蛋白能与花生过敏病人混合血清中的IgE结合,具有免疫原性.成功克隆并表达了花生过敏原Ara h2.02,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性.     

嗜根考克氏菌翻译延伸因子P基因的克隆、表达及其条件优化

为获得大量可溶性重组蛋白EF-P用以构建以EF-P蛋白为靶标的新型、高效抗细菌抗生素筛选模型,研究嗜根考克氏菌DC2201 efp基因的体外克隆、表达及表达条件的优化.首先对efp基因进行生物信息学分析,随后经PCR特异性扩增获得efp基因并将其插入表达质粒pET-29a(+)中,重组质粒(pET-29a(+)-efp)转化至表达宿主菌株E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,通过优化诱导表达条件(起始菌体浓度、温度、IPTG终浓度、时间)获得大量可溶性目的蛋白,最后对表达产物进行镍离子亲和层析柱纯化及SDS-PAGE、MALDI-TOF-TOF鉴定.结果获得相对分子质量大小约为25 kDa的蛋白条带,与预测的目的重组蛋白相对分子量大小相符.选择O_(D600 nm)     

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。     

虹鳟鱼造血器官坏死病病毒(IHNV)m基因的表达及免疫原性分析

根据NCBI中报道的造血器官坏死病病毒(IHNV)m基因序列设计特异性引物,提取病变组织中的RNA后,通过RT-PCR扩增得到m基因,大小约为570bp.与pET-22b连接,构建表达质粒pET-22b-m,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌株BL21(DE3)(pET-22b-m).挑取阳性克隆子,IPTG诱导,经SDS-PAGE验证,在21.6ku处有目的蛋白表达;Western blot表明目的蛋白与相应抗体具有很好的反应性;免疫小鼠后,经ELISA测定血清中抗体效价,为1∶128 000;虹鳟鱼攻毒试验,发现重组菌株BL21(DE3)(pET-22b-m)表达的蛋白对虹鳟的最高保护率为68%.本试验结果为研制造血器官坏死病病毒基因工程疫苗奠定了坚实的基础.     

人心室肌球蛋白轻链1基因的克隆及其体外的表达与纯化

通过聚合酶链式反应方法扩增人心室肌球蛋白轻链1的基因片段,并将其克隆到pET-22b质粒,构建表达重组体,转化大肠杆菌BL21细胞,转化子细胞经IPTG诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,凝胶成像扫描检测,其表达量接近细胞总蛋白的40%,经Ni2+亲和层析使目的蛋白得到纯化。     

GST和His标记的重组蛋白制备及吸附纳米ZnO的研究

以pET-28a(+)载体为模板人工设计引物,通过PCR反应扩增带有质粒上游6聚组氨酸(6×Histidine)序列的目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,筛选及鉴定阳性重组子pGEX-His,转化E.coli BL21细胞后通过IPTG诱导表达.由谷胱甘肽(GST)和6聚组氨酸标记的重组蛋白GST-His得到表达,利用Ni-NTA系统进行纯化.通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析鉴定,由LC-MS/MS质谱分析确定所得蛋白为目标产物.通过蛋白结合纳米无机材料的亲和吸附实验结果证实,重组的新蛋白表现出对纳米ZnO特异吸附的生物活性.     

人源温和气单胞菌溶血素基因的克隆与表达

根据GenBank报道的人源温和气单胞菌溶血素(hly)基因序列设计引物,经PCR扩增,得到大小约为1470bp的阳性产物.利用BamHⅠ,HindⅢ位点将hly基因片段克隆到pMD19-T载体,构建得到重组质粒pWT-hly,并比较所克隆基因序列的同源性.然后将该基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pWET-hly,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE分析.结果表明:克隆的hly基因与GenBank报道的溶血素基因同源性为96.19%;重组菌株经IPTG诱导后,hly基因得到了高效表达.     

人USP14蛋白在大肠杆菌中表达纯化的初步研究

采用PCR技术从人胎脑cDNA文库中克隆了usp14(ubiquitin-specific peptidase 14)基因编码区全长序列。序列分析表明人usp14基因含有peptidase蛋白酶C19A保守区,将usp14基因与pET-28b(+)载体相连,构建表达载体pET28b/usp14;把该表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)pLyS,以Isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导25°C 6小时,USP14蛋白获得高效表达。对表达产物进行Western blotting检测,并用Ni-NTA亲和层析技术获得了纯化的人USP14蛋白,表达的目的蛋白大小约为56kDa。     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.     

中国明对虾CrusFc-2基因的重组表达及抗血清制备

利用PCR和DNA重组技术克隆了中国明对虾CrusFc-2基因的成熟肽编码序列并构建了pET-DsbA-CrusFc-2原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到了重组蛋白.重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备了抗血清,Western Blot分析表明Crus...     

B型产气荚膜梭菌β毒素的表达与纯化

将构建好的表达产气荚膜梭菌β毒素的重组质粒pET-32a-β转化大肠杆菌BL21(DE3),将得到的重组菌株BL21(DE3)(pET-32a-β)用IPTG进行诱导表达,探究其最佳诱导时间.对所表达的β毒素包涵体进行变性、纯化和复性,获得了纯度较高的可溶性蛋白,动物免疫实验取得了良好的结果,为下一步抗产气荚膜梭菌β毒素的单克隆抗体和单链抗体的研究奠定基础.     

肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因（ldhD）,将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16U/mg和 0.07U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数K_M为10.54mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09g/L。     

盐藻磷酸果糖激酶DsPFK基因的原核表达及酶活测定

利用原核表达载体pET-32a构建盐藻磷酸果糖激酶DsPFK基因的表达载体pET-32a-DsPFK.转化大肠杆菌BL21(DE3),通过不同温度及不同浓度IPTG诱导后获得以包涵体形式表达的DsPFK重组蛋白,经亲和层析获得大小44.4kDa的纯化蛋白,通过柱上复性的方法测定重组DsPFK蛋白的酶活为950U.     

结核分枝杆菌H37Ra FadD3基因克隆与表达研究

为探索FadD3在结核分枝杆菌胆固醇分解代谢中的作用,从结核分枝杆菌H37Ra的全基因组中克隆了FadD3基因,并在大肠杆菌BL21中表达.根据NCBI公布的结核分枝杆菌全基因组序列设计一对引物,PCR扩增FadD3基因.PCR扩增产物与克隆载体pGEM3Zf(+)进行拼接,得到重组基因FadD3-pGEM3Zf(+),再转化到大肠杆菌DH5ɑ得到克隆.PCR检测阳性克隆,再与表达载体pYUB28b拼接,得到重组质粒FadD3-pYUB28b.阳性重组质粒亚克隆到大肠杆菌BL21宿主菌进行自体诱导表达.经过表型筛选及鉴定分析,已成功构建了重组表达质粒FadD3-pYUB28b.SDS-PAGE和Western blotting证实,重组基因FadD3-pYUB28b在大肠杆菌BL21中有表达产物.实验结果表明,以pYUB28b为表达载体,FadD3重组基因在大肠杆菌表达体系于温度分别为18,28 ℃有包涵体形式的表达蛋白,在37 ℃无表达产物.     

毛冠鹿AIF-1原核载体的构建及表达

从毛冠鹿睾丸cDNA文库中筛选出毛冠鹿AIF-1基因,对其进行生物信息学分析,设计引物克隆毛冠鹿AIF-1 cDNA,连入pMD19-T载体,测序正确后酶切,与表达载体pET-28a(+)连接,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,并对可溶性蛋白进行纯化,SDSPAGE电泳,Western Blot分析以及鉴定重组蛋白.结果表明,毛冠鹿AIF-1(TdAIF-1)含有1个438bp的开放阅读框,编码145个氨基酸,经测序和酶切鉴定后,成功构建重组质粒pET-28a(+)-TdAIF-1,表达大小约20 kD的重组蛋白,主要以可溶形式存在,提高洗脱缓冲液中咪唑浓度至50 mmol/L、100 mmol/L能够得到较纯的蛋白.成功构建毛冠鹿AIF-1原核表达体系,获得重组蛋白,为研究AIF-1蛋白的生物学功能奠定了基础.     

SHV-12型超广谱β-内酰胺酶的原核表达及免疫原性分析

利用PCR技术扩增了SHV-12 ESBLs目的基因,并将目的基因亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET-28a-SHV-12转化于表达菌株BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳分析.结果表明,目的蛋白SHV-12 ESBLs相对分子质量为30 KDa,经蛋白质印迹检测证...