GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

精氨酸激酶基因的蛋白表达及实时荧光定量分析

为构建棉铃虫精氨酸激酶基因(AK)的原核表达系统及确定2种不同品系的棉铃虫体内AK的表达量差异,以pET-28a质粒为表达载体,将AK基因重组转化至大肠杆菌BL21中进行原核表达。采用SDS-PAGE电泳及实时荧光PCR定量分析。结果表明:经IPTG诱导AK基因在大肠杆菌BL21得到表达,表达的融合蛋白其分子量与预测结果一致;石河子地区田间品系棉铃虫体内AK基因的表达量远远大于敏感品系棉铃虫体内AK基因的表达量为77.36%,表明石河子田间品系棉铃虫的生命代谢活动的能力要强于敏感品系。     

ZNF382多克隆抗体的制备及其在蛋白质水平的表达研究

在筛选心脏发育相关新基因的研究时,本人克隆出了在人类心脏组织特异表达的基因-ZNF382,ZNF382在mRNA水平上的表达情况已经报道,为了阐明该基因在蛋白质水平的表达情况,本研究用质粒DNA注射小鼠法,生产制备得到抗ZNF382蛋白的多克隆抗体,胚胎原位抗体染色结果初步显示ZNF382蛋白主要在心脏和骨骼肌表达,其蛋白质表达水平与mRNA的表达水平基本一致,进一步表明该基因很可能参与心脏的形成或对心脏功能的发挥起重要作用.     

盘基网柄菌allC的克隆、表达和多克隆抗体的制备

运用RT-PCR技术从盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)总mRNA中克隆到了尿囊酸酶基因(allC),该基因编码区开放读框长1 100bp,编码的蛋白约42kD.由于是在野生型和突变型细胞中差异表达的片段,表明该基因在盘基网柄菌多细胞发育中起到重要作用,因此将allC克隆入融合表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达带有6个组氨酸标签的尿囊酸酶(ALC)融合蛋白,经镍柱亲和层析,获得了电泳纯蛋白.用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.ELISA测得制备的抗ALC蛋白的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,Western Blotting检测证明该抗体有较强的针对ALC蛋白的专一性.这些数据表明重组质粒表达的ALC融合蛋白具有良好的抗原性,制备ALC的多克隆抗体有良好特异性和效价,能够满足针对ALC免疫印迹和细胞内定位检测等实验要求,为深入研究ALC蛋白在盘基网柄菌多细胞发育的功能作用提供了有力工具.     

对虾白斑综合症病毒P9蛋白转录水平的微阵列分析及其免疫荧光标记

从构建的对虾白斑综合症病毒cDNA文库中,我们筛选到一个拷贝数最高,编码82个氨基酸的基因(命名为p9,wsv230).该基因被克隆到pGEX-2T载体中进行GST融合蛋白的原核表达,纯化的融合蛋白GST-P9用于制备特异的多克隆抗体.利用微阵列技术和免疫荧光标记技术,对该蛋白的转录水平及其在感染细胞内的分布进行了初步研究,表明该基因为高丰度表达,推测是对虾白斑综合症病毒的一个重要基因.     

HIV-1复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

为表达HIV-1复合多表位基因并制备其多克隆抗体.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌.将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET32a并诱导表达.采用Ni2 -NTA亲和柱纯化目的蛋白,以p24抗体对纯化蛋白进行Western-blot分析.将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.通过PCR成功获得长度为651 bp的HIV-1的p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG基因,通过诱导表达,显示在相对分子量约45 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白.经此纯化的融合蛋白免疫的家兔能产生特异性抗体,其滴度达到1:3 200.纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型HIV疫苗奠定一定的理论和实践基础.     

发菜中麦芽寡糖基海藻糖合成酶的抗体制备及鉴定

通过PCR法从发菜总DNA中克隆到编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因前645bp的催化位点保守序列的片段,将该基因片段在大肠杆菌中表达,得到符合预期大小的重组蛋白．将该重组蛋白纯化回收用于制备该酶的特异性抗体．检测表明抗体具有较高效价．利用该抗体检测干旱胁迫下发菜藻丝体中该酶的表达量表明干旱胁迫条件下该酶的表达量增加：且与海藻糖积累量呈正相关,可能参与发菜的抗逆性保护作用．     

基于青藤碱的抗风湿性关节炎分子构建的研究进展

利用PCR技术扩增出BmDNV-1结构蛋白vp4基因,并将该基因与原核表达载体pMALc2X进行连接,转化大肠杆菌DH10B.获得重组质粒经IPTG诱导表达得到大小为96 000的融合蛋白,融合蛋白经Amylose柱纯化,使用其免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体.从而为进一步研究该病毒结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具.     

溶藻弧菌TssJ基因的原核表达及多克隆抗体制备

Tss J是溶藻弧菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)的一个重要基因.为了制备Tss J基因的多克隆抗体,以溶藻弧菌HN08155菌株的DNA为模板,扩增Tss J基因后利用表达载体PET-32a(+)和大肠杆菌BL21(DE3)原核表达,分离纯化后免疫大鼠获得Tss J基因的多克隆抗体.结果显示,37℃、IPTG终浓度1 mmol·L~(-1)是较适宜的表达诱导条件,表达的融合蛋白是存在于细胞内的包涵体,与预期的分子量42 k D一致,并且免疫大鼠后血清的多克隆抗体效价很高,为1∶32 768.制备的溶藻弧菌Tss J高效价多克隆抗体有助于进一步开展Tss J的定位和功能研究.     

伤寒沙门菌Mig-14蛋白部分密码子优化后的表达及多克隆抗体制备

通过原核表达Mig-14蛋白,制备相应多克隆抗体,用于后续Mig-14分子功能研究,为探寻Mig-14拮抗PB分子机制奠定基础.经密码子偏爱性分析显示mig-14基因含有8%的稀有密码子,综合考虑密码子偏好性、GC含量、限制性酶切位点等影响因素对密码子进行优化,重新合成mig-14基因,PCR获得周质空间部分,克隆至表达载体pET22b(+),并转入大肠埃希菌JM109中表达,KCl染色后切胶纯化的蛋白作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体.Mig-14蛋白多克隆抗体的制备为后续免疫共沉淀研究Mig-14的作用蛋白奠定了基础.     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

人膜蛋白CD81的原核表达与纯化

以高效原核表达载体pCold TF为载体骨架,应用PCR、限制性酶切、连接等分子生物学方法,将pCold TF中的六聚组氨酸(His-Tag)序列替换为限制性酶切位点SpeⅠ序列ACTAGT,构建不含His-Tag序列的新载体pL118.以此载体表达蛋白时,通过PCR引物在目的基因3′端添加His-Tag以利于融合蛋白的纯化以及融合蛋白中的Trigger Fac-tor(TF)助溶蛋白的去除.应用pL118对人膜蛋白CD81进行原核表达与纯化,并使用Fac-tor Xa蛋白酶去除CD81融合蛋白中的TF助溶蛋白,获得3′端含有His-Tag的CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表达纯化,为CD81靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81的功能奠定了基础.pL118载体的构建以及CD81蛋白的表达纯化为表达困难的基因实现原核表达提供了一种新的思路和方法.     

人NEDD8 原核表达及兔高免血清制备

摘要: 本研究根据基因比对,将合成的nedd8 基因( HN8) 酶切克隆入pCold-TF 原核表达载体中,命名为pCold-HN8,转化到感受态宿主菌BL21( DE3) 中,加入不同浓度异丙基硫代半乳糖苷( IPTG) 于16℃中诱导表达24 h,超声波裂解,通过His-bind 纯化试剂盒纯化,分别进行SDS-PAGE 检测,结果HN8 蛋白获得可溶性表达,融合蛋白大小为64 kDa。用纯化的蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,经Western Blot 和间接免疫荧光试验证实,兔抗HN8 蛋白的血清能够特异性识别HN8 蛋白。这为进一步研究HN8 蛋白在Neddylation 通路中的修饰作用奠定了基础。     

利用多克隆抗体检测纺锤体蛋白基因INMAP在肝癌细胞中的表达

 为探究纺锤体蛋白INMAP 的功能及其在细胞恶性增殖中发挥的作用,制备INMAP 多克隆抗体.利用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导His-INMAP 融合蛋白进行原核表达,SDS-PAGE 及免疫印迹检测蛋白表达.4.0 mol/L 尿素处理包涵体获得可溶性融合蛋白,镍亲和柱分离纯化融合蛋白抗原并检测蛋白浓度及纯度.以所获抗原免疫4 只Balb/c 小鼠,收集心脏抗血清.以纯化前、后的原核表达产物作为抗原,检测INMAP 多克隆抗体的特异性.通过免疫印迹分析INMAP 在正常肝细胞系L-02 及5个肝癌细胞系(PLC、HepG2、SUN449、SMMC-7721 和BEL-7402)中的表达差异.结果显示,His-INMAP 融合蛋白主要以包涵体形式存在,经4.0 mol/L 尿素处理可获得可溶性目的蛋白,且纯化后的抗原纯度较高(94.1%).INMAP 多克隆抗体能与INMAP 抗原特异结合.INMAP 在6 种肝细胞中具有多态性,除PLC 外,在其他肝癌细胞中其基因表达水平显著下调.本研究制备的INMAP 多克隆抗体特异性高,为INMAP 基因功能的进一步研究奠定了基础.     

恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

原核表达恶性疟原虫多期多表位基因并制备其多克隆抗体。在前期构建恶性疟原虫复合多期多表位重组真核表达载体的基础上,将测序正确的AMAMEG基因克隆入原核表达载体pGEX4T—1并诱导表达。采用包涵体洗涤的方式纯化目的蛋白,以AMA—1抗体对纯化蛋白进行Western—blot分析。将纯化的融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过PCR成功获得长度为1 000 bp的恶性疟原虫AMA—1胞外域基因片段,获得了与多表位基因连接后的AMAMEG基因。通过诱导表达,显示在相对分子量约95 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白。经此纯化的融合蛋白免疫的小鼠能产生特异性抗体,其滴度达到1∶105。纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型疟疾疫苗奠定一定的理论和实践基础。     

AhAO2融合蛋白表达、纯化与抗体制备

构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2,表达质粒在E.coliBL21中诱导表达,获得His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫,新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,West-ern blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.     

花生AhAO2基因融合表达、纯化与抗体制备

研究构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2的实验结果显示,重组pPROEX-Hta-AhAO2表达质粒在E.coli BL21中高表达His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,Western blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.