降钙素基因相关肽衍生物的制备及降血压功能研究

用PCR法将人的降钙素基因相关肽(calcitonin gene related—peptide,CGRP)基因克隆到表达载体pGEX-4T-2的GST基因后,构建成一个新的表达质粒pGEX—CGRP．另外分别将2个有降压功能的小肽HHL和RPLKPW的基因克隆到CGRP基因后,构建成2个表达质粒pGEX—CGRP-3AA和pGEX—CGRP-6AA．将此3个表达质粒转化到大肠杆菌TG1中,获得3个高表达的融合蛋白：GST—CGRP,GST—CGRP—HHL,GST—CGRP—RPLKPW;通过G1utathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白,测定蛋白浓度,利用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)来检测蛋白的降血压功能,发现融合蛋白GST—CGRP—HHL具有显著的降压效果,能使舒张压下降8．0kPa,且降压维持时间延长,达到70min以上．     

人类HDAC4和MIF4GD蛋白相互作用的初步研究

以HDAC4为“诱饵”,利用酵母双杂交系统筛选人肝cDNA文库得到“猎物”蛋白,通过GST Pull-down,Co-IP,荧光共定位等技术验证HDACA和“猎物”的特异性结合,并通过成人多组织cDNAPanel确定“猎物”的组织表达谱．通过体内、外蛋白结合实验证实了HDACA与MIF4GD（MIF4G domaincontaining）蛋白特异性互作,且两者亚细胞共定位于细胞质内,并确定了MIF4GD在胎盘、肝脏和胰腺中有特异性表达．本实验发现并验证了HDACA与MIF4GD的特异性互作,并确定了MIF4GD的特异性表达谱,为深入研究两种蛋白的功能及其所参与的生理过程提供了新的线索．     

人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

高浓度c—Myc羧基端的体外自身二聚体化活性

将编码人c-myc羧基端bHLH／LZ结构域的92个氨基酸的cDNA片段（c-myc-c92）对框插入pGEX－2T原核表达载体中,使之与谷胱甘肽转移酶（GST）编码基因融合,并将重质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,由IPTG诱导融合基因高效表达,并用Glutathione Sepharose4B亲和柱纯化融合蛋白GST－c-Myc-c92,凝胶阻滞（EMSA）分析显示该纯化蛋白能与CACGTG序列特异结合,并且只有高浓度的GST－c-Myc-c92才能与探针结合,结果表明在体上情况下高浓度c-Myc羟基端能自身二聚体化,此发现丰富了Myc-Max-Mad的调控网络,并为进一步研究c-myc的功能和调控提供了一定的线索。     

汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究

为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果，将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O．7kb的片段连接，克隆入pGEX一4T2，构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0．7，pGEX-4T2-S0．7G1，在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0．7或GST—S0．7G1融合蛋白。经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合，融合蛋白GST—G1S0．7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示，诱导出G1S0．7或S0．7G1与GST的融合蛋白，其中G1S0．7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明：两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白，但表达效果不同，为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

PMEPA1蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

为了从蛋白水平上检测前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protain,androgen induced 1)在细胞内的表达和功能,构建了原核表达重组质粒pTrcHisA-PMEPA1和pGEX4T-2-PMEPA1,转化大肠杆菌BL21-RIPL后,IPTG诱导蛋白表达,分别用Ni-NTA和谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。用His-PMEPA1免疫兔子制备抗体,并用GST-PMEPA1对抗体进行纯化。免疫印迹检测显示抗体能够特异识别细胞中内源PMEPA1蛋白。     

大肠杆菌中融合表达汉滩病毒S,M基因片段的研究

为在大肠杆菌中融合表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP含主要抗原位点的片段 .将汉滩病毒 76 118株S基因编码区 5′端约 0 .7kb的片段与M基因编码G1的片段连接 ,克隆入 pGEX 4T2 ,构建嵌合基因原核表达载体 pGEX 4T2 S 0 .7G1,在大肠杆菌XL1 Blue中诱导GST S0 .7G1融合蛋白的表达 .表达产物用ELISA和Westernblot进行鉴定 .限制性内切酶酶切鉴定证明 ,成功构建了嵌合原核表达载体 pGEX 4T2 S0 .7G1.经IPTG诱导后 ,ELISA活性测定结果表明 ,该融合蛋白可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合 .Westernblot结果显示 ,诱导出相对分子质量 (Mr)大于 1× 10 5的S0 .7G1与GST的融合蛋白 ,并有一系列大小不等的可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合的蛋白带 .获得具有特异性结合活性的融合蛋白GST S0 .7G1,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础     

GST pull-down技术验证CIPK7蛋白激酶与CBL1蛋白的相互作用

采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组质粒,经诱导表达及纯化获得了可溶性GSTCIPK7和CBL1-His融合蛋白,GST pull-down试验证实了CBL1能够与CIPK7结合.CIPK7蛋白与CBL1蛋白之间存在直接的相互作用,为进一步研究蛋白激酶CIPK7的功能奠定了基础.     

小鼠Pem-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：为制备重组小鼠Pem（以下简称mPem）-谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白，作为研究mPem蛋白功能的材料，方法：根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物，PCR扩增小鼠Pem基因编码序列，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-3中，得到重组表达质粒pGEX-4T-3/mPem，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导重组菌表达mPem蛋白，SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达产物。结果：重组菌株明显诱导表达出预期相对分子质量49000的融合蛋白。结论：成功构建了mPem-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出mPem-GST融合蛋白，为mPem蛋白功能的研究打下了基础。     

FOXM1688-748结构域相互作用蛋白的鉴定

为了鉴定转录因子FOXM1转录激活结构域(C-端第688位到748位氨基酸序列)的互作蛋白,以FOXM1的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法扩增获得其转录激活结构域序列,克隆进入原核表达载体pGEX-4T2;利用大肠杆菌原核表达获得融合谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)标签的重组蛋白GST-FOXM1688-748;通过GST-pulldown结合质谱方法鉴定FOXM1688-748的互作蛋白,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T2-FOXM1688-748,获得了原核表达的重组蛋白GST-FOXM1688-748.将质谱鉴定获得的互作蛋白进行分析和归类,预示一些互作蛋白可以参与激活FOXM1的转录活性,如RPN2、MISP、MCM7蛋白,一些互作蛋白可以参与调控FOXM1蛋白的稳定性,如USP9Y、CUL4A、HSPB1、BAG2蛋白.FOXM1蛋白的转录激活结构域与许多不同功能的蛋白发生相互作用,暗示该结构域具有重要的分子生物学作用,期望为以FOXM1为靶点的临床药物研发提供实验依据.     

MTMR14稳定敲减细胞株的建立及表型分析

目的: 为了解析芽殖酵母 Num1 蛋白在纺锤体定位和线粒体中的调节机制．方法: 利用大肠杆菌原核表达 并纯化了在 Num1 功能中起核心作用的补丁组装(PA) 结构域的重组蛋白, 通过蛋白体外结合实验(Pull-down) 分 离了酵母细胞中与 PA 结构域相结合的蛋白复合物,并对其进行了质谱分析．结果: 鉴定了一系列新的 Num1 互作蛋 白,包括核糖体蛋白,参与蛋白折叠、分配及转运的内质网和高尔基复合体蛋白, 参与基因转录和翻译的核酸酶和 蛋白酶,及其他功能的蛋白．结论: Num1 的互作蛋白的鉴定为进一步研究 Num1 的作用机制奠定了基础．     

双分子荧光互补技术及其在蛋白互作研究中的应用

双分子荧光互补（bimolecula fluorescence complementation,BiFC）是近年新发展起来的在活细胞中研究蛋白质互作及其定位的新技术．该技术巧妙的将荧光蛋白切成不发光的两个片段,并与目的蛋白融合表达．如果目的蛋白相互作用,连接其上的荧光互补蛋白片段将会相互靠近并恢复荧光活性,从而实现了分子与细胞事件的可视化．BiFC既可以验证蛋白之间的互作、检测其互作强弱,还可以定位互作蛋白的位点．基于双分子荧光蛋白的应用已经越来越广泛,本文对双分子荧光互补技术的原理、应用现状、特点及其面临的问题进行了概述．     

蛋白体外结合实验联合质谱分析鉴定 Num1 的互作蛋白

目的: 为了解析芽殖酵母 Num1 蛋白在纺锤体定位和线粒体中的调节机制．方法: 利用大肠杆菌原核表达 并纯化了在 Num1 功能中起核心作用的补丁组装(PA) 结构域的重组蛋白, 通过蛋白体外结合实验(Pull-down) 分 离了酵母细胞中与 PA 结构域相结合的蛋白复合物,并对其进行了质谱分析．结果: 鉴定了一系列新的 Num1 互作蛋 白,包括核糖体蛋白,参与蛋白折叠、分配及转运的内质网和高尔基复合体蛋白, 参与基因转录和翻译的核酸酶和 蛋白酶,及其他功能的蛋白．结论: Num1 的互作蛋白的鉴定为进一步研究 Num1 的作用机制奠定了基础.     

对虾白斑综合症病毒类锌指蛋白基因(wsv063、wsv069和wsv477)的表达和纯化

从对虾白斑综合症病毒基因组的预测开放阅读框中选取3个编码类锌指蛋白的基因训wsv063、wsv069和伽wsv477，将它们克隆到pET—GST表达载体，以E．coli BL21（DE3）为宿主菌，成功表达了GST融合的目的蛋白．表达的GST-WSV063和GST—WSV477在菌体里主要以包涵体形式存在，GST-WSV069在菌体里可溶性形式和包涵体形式几乎等量存在．采用glutathione sepharose4B或Ni-NTA agarose亲和层析对目的蛋白进行了纯化．以上3种病毒蛋白的表达和纯化为进一步研究它们的功能奠定了基础．     

中华绒螯蟹免疫蛋白互作网络提取及分析

为了研究中华绒螯蟹的免疫蛋白作用机制,在已构建的中华绒螯蟹蛋白互作网络基础上,采用邻接节点注释方法对其全局网络进行细胞组分注释,为网络的903个未定位蛋白中的830个添加了GO注释,占未定位蛋白的91.9%.从中华绒螯蟹蛋白互作网络中提取了包含142个蛋白和158条蛋白互作关系的免疫互作网络,并且结合GO细胞组分注释信息,得到了其中62个免疫蛋白的细胞组分定位.通过对细胞定位的分析发现,中华绒螯蟹的免疫蛋白多位于膜结构、细胞核和细胞骨架中.     

GST—hBTLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBTLyS（human Blymphocte stimulator）基因序列设计合成特异性引物。用RT－PCR从人外周血淋巴细胞扩增出858bp的hBLyS基因，并将其插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达质粒pGEX-4T-1/hBLyS.把此重组质粒转化大肠杆菌BL21，经用IPTG诱导，表达出GST－hBLyS融合蛋白。     

丙型肝炎病毒NS5A基因的克隆以及在原核和昆虫细胞中表达的研究

克隆了丙型肝炎病毒的NS5A基因，并在细菌和昆虫两种不同的系统中成功地进行了该基因的表达。利用PCR方法获得了NS5A完整的编码区并克隆到原核表达载体pGEX—KG上，在大肠杆菌中诱导表达了78kDa的NS5A与GST的融合蛋白。同时发现，融合蛋白被部分切割为50kDa的NS5A和28kDa的GST。在原核细胞中表达的78kDa和50kDa两种蛋白均具有较高的免疫原性，通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清。另外，利用两种昆虫表达系统，即AcMN—PV和HaSNPV的Bac-to-Bac系统对NS5A进行了表达，表达产物为58kDa。     

东亚正钳蝎毒素基因BmKbpp的原核表达及其抗菌功能初步鉴定

一级结构分析和二级结构预测表明无二硫键蝎毒液多肽(NDBPs)BmKBPP具两亲性α-Helix结构,含有大量带净正电荷的碱性残基(Arg和Lys),符合多价阳离子抗菌肽的典型特征。采用PCR法和质粒载体pGEX-5X-1构建BmKbpp、EGFP及BmKbpp/EGFP与GST的原核融合表达载体,3个表达载体与pGEX-5X-1分别在Rossetta(DE3)菌中进行表达,并测定4个Rossetta(DE3)表达工程菌诱导表达的生长曲线。结果表明,BmKBPP是一个具有很强抑菌功能的抗菌肽,GST、BmKBPP及EGFP3个蛋白一起融合表达可获得少量蛋白的表达,这将为后续的功能研究和应用研究奠定基础。     

鸭茅斑驳病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

通过RT-PCR技术从鸭茅斑驳病毒(CfMV)总RNA中获得了外被蛋白(CP)基因,并将其连接到含有编码GST基因的表达载体pGEX-4T-1后,得到重组质粒pGEXCfMV-JANCP,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLys后,用IPTG诱导其基因表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析后证明:CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子质量约为56．0 ku．