中华鳖实时定量PCR内参基因的筛选与评价

选择合适的内参基因是采用q-PCR方法研究基因表达的前提.选取中华鳖GAPDH、EF1α、18SrRNA、Tubulin和β-actin等5个候选内参基因,通过q-PCR方法得到各基因在不同组织中的Ct值,利用4种内参筛选软件和综合评定法进行评价.geNorm和NormFinder软件分析均显示18SrRNAEF1αβ-actinGAPDHTubulin(稳定性由高到低).BestKeeper软件分析显示18SrRNAGAPDHEF1αβ-actinTubulin.RefFinder软件分析和综合评价法显示18SrRNA最佳.推荐优先使用18SrRNA或EF1α,不建议用β-actin和Tubulin.上述结果可为中华鳖和其它爬行动物的基因表达研究提供参考依据.     

杂色鲍幼虫变态及TR干扰下内参基因的筛选

内参基因的稳定性对实时定量PCR的结果影响巨大。采用Ge Norm、norm Finder和Ref Finder三款软件比较了鲍变态和干扰幼虫甲状腺激素受体(TR)两种情况下内参基因的稳定性。软件分析了EIF5A、OAZ1、YB1、RPL3、RPS9和ACT等6个候选内参基因的C_t值,据此获得各基因的稳定值。在杂色鲍幼虫的变态过程中,EIF5A稳定性最高,排名平均数为1,表明该基因可以作为这一阶段实时定量PCR的内参基因,但是在干扰TR情况下,EIF5A的稳定性下降,排名平均数为3.91。RPS9则与之相反,在变态过程该基因表达稳定性最差,而在干扰TR时表达稳定性最好。ACT在两种情况下稳定性较好,排名平均数均位列第二位,可以作为这两种情况下的通用内参基因。其他基因的稳定性在这两种情况下也发生剧烈变换。这表明内参基因的稳定与样品具体处理情况关系密切。为了保证定量PCR结果的准确性,需要针对具体处理情况相应地进行内参基因的稳定性评估。     

H1N1猪流感病毒感染猪血管内皮细胞后内参基因的筛选

旨在评价H1N1猪流感病毒感染猪血管内皮细胞(PUVEC)后,肽基脯氨酰异构酶A(Ppia)、β-肌动蛋白(Actb)、核糖体蛋白L4(Rpl4)、酪氨酸3/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白(Ywhaz)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)等5个内参基因的稳定性.采用Real-time RT-PCR方法测定H1N1 SIV感染PUVEC后3、6、9、12、15、18、24和30h时5个内参基因mRNA的表达水平,未感染PUVEC为对照,采用2-△Ct值对内参基因进行相对定量,应用Genorm软件对其稳定性进行评价.结果表明,5个内参基因的稳定性由高到低分别为Ppia和Rpl4、Ywhaz、Actb、Gapdh,其中Ppia和Rp14稳定性相同.据此可知,Ppia和Rpl4在所选的5个内参基因中是研究H1N1 SIV与机体互作理想的2个内参基因.     

授粉后红球姜雌性生殖器官qRT-PCR的内参基因筛选

在研究分析红球姜（Zingiber zerumet (L.) Smith）败育关键调控基因的表达中，筛选授粉后雌性生殖器官发育过程中的内参基因至关重要。本研究根据授粉后不同时间点的红球姜转录组数据库以及相关文献报道的传统内参基因，筛选出10个表达相对稳定的基因Actin-2（ACT2）、Actin-7（ACT7）、Beta tubulin-1（TUB1）、Beta tubulin-5（TUB5）、Alpha tubulin-3（TUA3）、Ubiquitin（UBQ）、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Elongation factor 1-alpha（EF-1）、Cyclophilin（CYP）、Histone（H2A）作为候选内参基因，采用qRT-PCR技术，结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参基因的表达稳定性进行分析。结果表明，在红球姜雌性生殖器官授粉后的发育过程中，GAPDH和UBQ的表达稳定性最好，均适合作为内参基因，且同时使用两种作为内参基因能使实时荧光定量PCR标准化分析结果更精确。因此，最终选择GAPDH和UBQ作为实时荧光定量PCR标准化分析红球姜雌性生殖器官相关基因表达的内参基因。本研究将为探究红球姜败育的分子机理奠定基础，也为近源姜属植物内参基因的筛选提供线索。     

盐胁迫下蚕豆不同组织实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选出蚕豆盐胁迫下不同组织中表达稳定的内参基因,本研究以不同浓度氯化钠胁迫下的蚕豆叶片、茎、根为材料,利用实时荧光定量PCR技术检测ELF1 A、ACT2、GAPA、18S rRNA、TUA和CYP2六个候选内参基因的表达情况;通过Ct值分析、及GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件综合分析候选...     

青海茄参不同部位内参基因表达稳定性分析

为探究青海茄参不同部位稳定表达的内参基因,本研究以青海茄参根、茎、成熟果实及成熟叶片为试验材料,选取6个内参基因(Actin7-NT、18S rRNA、TUA、ELF4、ELF6和GAPCP2),采用实时荧光定量qRT-PCR技术,并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt及RefFinder 5种方法分析候选内参基因的表达稳定性,筛选青海茄参中稳定性最佳的内参基因。结果表明：18S rRNA为青海茄参根及成熟叶片中最佳稳定内参基因,ELF4为青海茄参茎及成熟果实中最稳定的内参基因。综合分析结果为青海茄参不同组织中表达最稳定的内参基因是Actin7-NT,该结果可为后续挖掘青海茄参相关基因及代谢、蛋白等功能分析提供理论依据。     

大熊猫核糖体蛋白RPL5基因的克隆、表达与比较分析

为了解大熊猫(Ailurophilic melanosome)核糖体蛋白亚基RPL5基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPL5基因的异同,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中和DNA中分别对核糖体蛋白亚基RPL5基因的表达序列和其结构基因进行了克隆、测序;采用ORF finder软件对表达序列的开放阅读框(ORF)进行了查找和氨基酸序列的推定;采用Gen scan对结构基因进行了分析;采用DNAMAN Version 6对基因序列和氨基酸序列进行了同源性比较;采用ExPASy软件进行蛋白质功能位点和生化特性进行了预测分析;对大熊猫核糖体蛋白亚基RPL5基因进行了超表达实验.结果表明:大熊猫RPL5结构基因长为8 633bp,具有8个外显子和7个内含子;mRNA长为918bp,ORF为894bp,编码295个氨基酸,该蛋白的相对分子质量为34 402.6,等电点为9.73,含有1个依赖于AMP和GMP的蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,8个十四(烷)酰化位点.分析表明,大熊猫RPL5基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物包括人(Homo sapiens)、牛(Bos Taurus)、猪(Sus scrofula)、小家鼠(Mus altocumulus)和褐家鼠(Rat-hauser nonstrategic)具有很高的相似性,大熊猫RPL5核苷酸序列与这些物种的相似性分别为94.52%、92.51%、91.95%、91.05%和89.15%,而氨基酸序列相似性分别为99.33%、98.65%、98.65%、98.32%和98.65%.超表达实验结果显示:大熊猫RPL5基因能在大肠杆菌BL21中有效表达,且在2h时达到表达高峰.运用分子生物学原理与相应的技术手段,成功地扩增出大熊猫RPL5基因的表达序列,并对其编码的蛋白进行了初步分析,丰富和完善了哺乳动物RPL5基因资料库,同时也为深入研究大熊猫RPL5基因的功能提供了相关基础数据.     

六溴环十二烷胁迫下红树蚬荧光定量PCR内参基因稳定性分析

【目的】筛选出不同浓度六溴环十二烷(HBCD)胁迫下红树蚬(Polymesoda erosa)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的最适内参基因,用以准确校准目的基因的表达,为进一步开展分子毒理研究和开发分子生物标志物奠定基础。【方法】通过荧光定量PCR技术监测候选内参18S核糖体RNA(18S rRNA)、β-肌动蛋白(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、α-微管蛋白(α-tubulin)等管家基因,在红树蚬各组织受不同浓度(0μg/L、0.86μg/L、8.6μg/L)六溴环十二烷(HBCD)胁迫后的表达量,利用qRT-PCR及geNorm、NormFinder、BestKeeper等分析软件对不同条件下的表达数据进行处理,从而筛选出适合荧光定量PCR的最佳内参基因。【结果】受不同浓度HBCD胁迫后,鳃及肝胰中各管家基因的表达稳定性排序整体为β-actin=α-tubulinGAPDH18S rRNA。【结论】可单独或共同使用两个内参基因(β-actin、α-tubulin)校准荧光定量结果。     

多氯联苯胁迫下红树蚬荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出多氯联苯(PCBs)胁迫下红树蚬(Polymesoda erosa)的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)最适内参基因,为进一步开展分子毒理学研究奠定基础。【方法】以β?actin、18S rRNA、GAPDH和#?tubulin为候选内参基因,qRT-PCR测定PCBs胁迫下4个候选内参基因在红树蚬外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺组织中的表达水平,应用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析其表达稳定性。【结果】geNorm软件分析表明β?actin表达最稳定;NormFinder软件分析发现,外套膜、鳃和肝胰腺组织中β?actin的稳定性最好,闭壳肌组织中β?actin(0.454)表达稳定性略微低于#?tubulin(0.425),排第2位;BestKeeper软件分析表明,外套膜和鳃组织中β?actin最稳定,肝胰腺和闭壳肌组织中GAPDH最稳定,β?actin排位第2位。【结论】筛选β?actin为红树蚬在PCBs胁迫下的qRT-PCR最适内参基因。     

工业大麻种子萌发及渗透胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选适用于工业大麻种子正常萌发与渗透胁迫下萌发的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)内参基因,研究以‘云麻7号’种子为试验材料,设置正常萌发和20%PEG渗透胁迫下萌发处理.利用qRT-PCR技术对10个候选参考基因（CDPK,e IF4E,TIP41,UBQ,EF1α,PP2A,Actin,Clathrin,TUB,DHS2）在3个萌发时间点（萌发3、5、7 d）幼苗中的表达量进行检测.通过GeNorm、Normfinder和BestKeeper三种软件包对内参基因表达稳定性进行评价,再利用RefFinder在线软件进行综合分析,从而获得稳定、适宜的内参基因.结果表明,在工业大麻种子正常萌发过程中,PP2A基因的稳定性最好.在渗透胁迫下的种子萌发中,UBQ基因的稳定性最好.综合两组结果得出,eIF4E内参基因的表达最稳定.研究结果确定了工业大麻种子萌发及渗透胁迫下进行qRT-PCR分析的最适内参基因,为今后研究工业大麻种子萌发响应渗透胁迫相关基因的表达提供前期基础.     

一株高效抑藻放线菌的分离筛选及鉴定

从福建云霄国家红树林自然保护区滩涂沉积物样品中,共分离获得521株纯培养物.通过检测球形棕囊藻(Pha-eocystis globosa)荧光强度计算抑藻率,从521株菌中筛选到27株具有抑藻活性的菌株.在27株抑藻菌中,菌株O3-26对球形棕囊藻具有最高的抑藻率(高达96.71%).菌株O3-26的抑藻谱实验显示,该菌株抑藻活性表现出一定的种属特异性,对硅藻门(Bacillariophyta)的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum)2株测试藻株没有抑制作用,而对绿藻门(Chlorophyta)盐生杜氏藻(Dunaliella salina)和自养小球藻(Chlorella autotrophi-ca)2株藻株具有较强抑藻作用.扫描电镜观察显示,该菌株孢子丝直至螺旋状且孢子表面带刺.生理生化实验显示,该菌株在所得到的大多数培养基上生长良好,在营养琼脂培养基中可以产生水溶性色素;不能在棉子糖作为唯一碳源的培养基上生长.16SrRNA基因相似性分析表明,菌株O3-26属于链霉菌属(Streptomyces),并与灭癌素链霉菌(Streptomycesgancidicus)15412菌株具有最高的同源性(99%).生理生化实验表明,二者之间生理特征存在一定差异.综合形态特征、生理特征以及系统发育分析的结果,鉴定该菌株为灭癌素链霉菌.     

苯并[a]芘(BaP)对真鲷细胞色素P450和芳香烃受体基因表达的影响

通过水体暴露方式对海水养殖真鲷进行BaP持续染毒,利用实时定量PCR技术研究了真鲷细胞色素P450基因(CYP1A1)和芳香烃受体基因(AhR2)随BaP暴露剂量、时间的动力学变化.结果发现,0.1～1.5 μg/L环境浓度的BaP能够显著性诱导CYP1A1基因和AhR2基因的表达,且AhR2 mRNA早于CYP1A1 mRNA被诱导表达;BaP持续暴露48 h,CYP1A1和AhR2基因的表达水平均随暴露时间的延长而显著升高,染毒72 h后又回复到本底水平,实验表明这两个基因的表达与BaP的暴露剂量和暴露时间之间具有显著性的剂量-效应和时间-效应关系.     

扩展青霉菌实时定量PCR内参基因挖掘与应用

实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术因其高效且便捷的特点在基因表达检测中被广泛应用。实时定量PCR结果数据处理策略之一是使用内参基因进行基因表达数据的标准化。文章基于扩展青霉菌孢子不同生长阶段的RNA-seq数据，挖掘和注释了694个稳定表达的候选内参基因；随机挑选出Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase在内的14个基因，以4、25℃条件下PDB培养基生长6、12、24、36 h的扩展青霉菌为材料，进行实时定量PCR实验。实时定量PCR数据基于geNorm和NormFinder 2种软件的综合分析，表明Isy1、Spt5、Nucb、Hp1适合作为内参基因。以Isy1和Spt5分别作为内参基因，检测Gh30基因在4、25℃条件下扩展青霉菌生长发育过程中的基因表达，显示出一致的基因表达水平，进一步验证了挖掘得到的内参基因的可靠性。该研究为扩展青霉菌的分子生物学研究提供了优良的内参基因，同时提供了一种高效的内参基因的挖掘和鉴定方法。     

苯并〖DK(〗［a］芘(BaP)〖DK)〗对真鲷细胞色素P450和芳香烃受体基因表达的影响

 通过水体暴露方式对海水养殖真鲷进行BaP持续染毒,利用实时定量PCR技术研究了真鲷细胞色素P450基因(CYP1A1)和芳香烃受体基因(AhR2)随BaP暴露剂量、时间的动力学变化。结果发现,01～15 μg/L环境浓度的BaP能够显著性诱导CYP1A1基因和AhR2基因的表达,且AhR2 mRNA早于CYP1A1 mRNA被诱导表达;BaP持续暴露48 h,CYP1A1和AhR2基因的表达水平均随暴露时间的延长而显著升高,染毒72 h后又回复到本底水平,实验表明这两个基因的表达与BaP的暴露剂量和暴露时间之间具有显著性的剂量-效应和时间-效应关系。     

藜麦内参基因筛选及盐胁迫相关基因表达分析

为了利用实时荧光定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)分析藜麦(Chenopodium quinoa Willd)相关基因表达,提高结果的准确性,筛选出稳定表达的内参基因至关重要.我们分别利用geNorm、NormFinder和Bestkeeper程序分析了6个藜麦候选内参基因在NaCl胁迫下表达的稳定性,并用实时荧光定量PCR技术对藜麦盐胁迫相关基因P5CS1和CMO基因相对表达量进行分析.结果表明,藜麦在NaCl胁迫下ACT-1和TUB-6做为内参基因表达最稳定,为最佳内参基因;藜麦P5CS1基因表达水平上调6倍左右,CMO基因上调30～40倍.本研究为NaCl胁迫下藜麦基因表达分析提供了可靠的内参基因,并且对NaCl胁迫下P5CS1和CMO基因表达情况做出初步分析.     

嗜热蓝细菌PKUAC-E542藻蓝蛋白耐热性以及不同光照条件对其含量影响研究

对PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白的耐热性进行测试, 探究其热稳定性能。同时, 在不同光周期和不同光质光源组合条件下培养嗜热蓝细菌PKUAC-SCTE542, 研究其生长情况和藻蓝蛋白含量, 探索适用于藻蓝蛋白生产的光照条件。选取30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 65°C, 70°C, 80°C, 90°C为实验组, 25°C和4°C为对照组, 放置时间设为5小时和14天, 用紫外分光光度计测定藻蓝蛋白全光谱图, 考察不同温度和放置时间对藻蓝蛋白的影响, 再将E542-PC的α链和β链与蛋白质晶体结构数据库中藻蓝蛋白进行比对, 深入了解其耐热机制。分别在光波长为白光(400~800 nm) 、红光(654 nm) 、绿光(511 nm) 和蓝光(454 nm), 光周期为8L/16D, 12L/12D和16L/8D的条件下培养蓝细菌, 测定其生物质干重以及藻蓝蛋白含量。结果表明, PKUACSCTE542藻蓝蛋白在 65°C 环境可以保持稳定, 60°C放置14天仍表现出60%的热稳定性。光质为红光、光周期为16L/8D的条件下, 藻蓝蛋白绝对产量最大; 光质为红光、光周期为8L/16D时, 藻蓝蛋白产率最高。实验结果表明PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白的耐热性能较好, 经过光照条件筛选, 藻蓝蛋白产量可提高近100 mg/gDCW。     

核糖体蛋白RPL34-PS1对B细胞淋巴瘤的生长促进作用

一种核糖体蛋白RPL34具有促进B细胞淋巴瘤生长的作用,通过分子克隆将RPL34基因的序列克隆到逆转录病毒载体pBABE-Puro上后,包装逆转录病毒并感染Balb/c小鼠来源的B淋巴瘤细胞38B9,经嘌呤霉素筛选后构建稳定过表达RPL34的B淋巴瘤细胞系RPL34-38B9。体外培养计数比较细胞增殖变化情况;流式检测细胞凋亡和细胞周期水平;小鼠皮下荷瘤并测量肿瘤体积。结果表明:过表达的核糖体蛋白RPL34能够显著促进B淋巴瘤细胞的生长速率,减少细胞凋亡,同时能够显著增加B淋巴瘤细胞的成瘤速率。     

石油微生物16SrRNA基因PCR扩增研究

掌握石油微生物的16SrRNA基因保守区的扩增方法是先进分子水平鉴定微生物种类一种有效的实验方法。通过研究利用分子生物技术提高对石油微生物的了解,进行未来对石油的开采,摸索出石油微生物的DNA提取方法,16SrRNA基因的PCR扩增反应条件的研究进而初步鉴定菌种类型。本文是以大庆采油三厂分离纯化的石油微生物为实验材料,摸索合适的石油微生物基因组DNA的提取方法及合适的PCR扩增条件和反应体系,在本实验室后续开展石油微生物在分子水平方面的实践指导中有重要意义。     

R-藻蓝蛋白的分离纯化及抗食物过敏活性研究

为探究R-藻蓝蛋白抗过敏功效,以坛紫菜为原料,通过25%～35%硫酸铵盐析和DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 HR两步柱层析获得了高纯度的目的蛋白(A620/A280>6.0).SDS-PAGE显示,该蛋白质由分子质量为17.7 ku和20.5 ku的两个亚基组成,紫外可见分光光度法测得其在620 nm、555 nm有两个特征吸收峰,可确认其为R-藻蓝蛋白.热稳定性和pH值稳定性实验结果显示,R-藻蓝蛋白在低于35℃、pH=4.0～9.0条件下光谱性质相对稳定.动物实验结果表明,100μg/mL高纯度R-藻蓝蛋白能够显著降低小鼠血清中IgE水平;细胞实验结果表明,40μg/mL R-藻蓝蛋白能够降低细胞因子IL-4、IL-13的蛋白质分泌量;基因表达量分析结果显示,R-藻蓝蛋白能够降低IL-4在淋巴细胞中的表达量.可见,坛紫菜R-藻蓝蛋白通过促使CD4+T cell向TH1型转化发挥抗食物过敏活性.     

雌二醇和甲基睾酮暴露对食蚊鱼CYP19a表达的影响

探讨17β-雌二醇(E2)和17ɑ-甲基睾酮(MT)暴露对食蚊鱼(Gambusia affinis)CYP19a基因表达的影响。采用静水暴露方法,分别设置2、10、50、100 ng/L E2和MT各4个实验组,并设置对照组和平行组,定量测定第7,14,21,28 d性腺组织CYP19a mRNA表达水平的变化。E2暴露实验结果显示,初始相对较低浓度的E2(2、10 ng/L)对食蚊鱼CYP19a基因的表达起促进作用,而较高浓度的E2(50、100 ng/L)对CYP19a起抑制作用;随着暴露时间的延续,食蚊鱼CYP19a基因的表达受低浓度E2的影响不明显,而高浓度的E2则极明显上调食蚊鱼CYP19a基因的表达。MT暴露的实验结果显示,初始所有MT实验浓度组(2、10、50、100 ng/L)均对食蚊鱼CYP19a基因起促进作用;随着暴露时间的延长,较低浓度MT对食蚊鱼CYP19a基因产生的影响不明显,较高浓度的MT则显著性地抑制食蚊鱼CYP19a的表达。结果表明,两种典型环境激素对食蚊鱼CYP19a基因表达的影响十分显著,鱼类CYP19a基因mRNA表达适合作为环境激素污染的生物标志物。