盐胁迫下蚕豆不同组织实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选出蚕豆盐胁迫下不同组织中表达稳定的内参基因,本研究以不同浓度氯化钠胁迫下的蚕豆叶片、茎、根为材料,利用实时荧光定量PCR技术检测ELF1A、ACT2、GAPA、18S rRNA、TUA和CYP2六个候选内参基因的表达情况;通过Ct值分析、及GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件综合分析候选内参基因表达稳定性。结果表明:在不同浓度氯化钠处理下,蚕豆叶片中候选内参基因表达稳定性由高到低排序为ACT218S rRNACYP2ELF1AGAPATUA;蚕豆茎中候选内参基因表达稳定性由高到低排序为CYP2ACT2ELF1AGAPA18S rRNATUA;蚕豆根中候选内参基因表达稳定性由高到低排序为CYP2ELF1A18S rRNAACT2TUAGAPA。本研究确定的蚕豆在盐胁迫下不同组织中适宜的内参基因,可为后续研究与盐胁迫相关功能基因提供理论依据。     

授粉后红球姜雌性生殖器官qRT-PCR的内参基因筛选

在研究分析红球姜（Zingiber zerumet (L.) Smith）败育关键调控基因的表达中，筛选授粉后雌性生殖器官发育过程中的内参基因至关重要。本研究根据授粉后不同时间点的红球姜转录组数据库以及相关文献报道的传统内参基因，筛选出10个表达相对稳定的基因Actin-2（ACT2）、Actin-7（ACT7）、Beta tubulin-1（TUB1）、Beta tubulin-5（TUB5）、Alpha tubulin-3（TUA3）、Ubiquitin（UBQ）、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Elongation factor 1-alpha（EF-1）、Cyclophilin（CYP）、Histone（H2A）作为候选内参基因，采用qRT-PCR技术，结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参基因的表达稳定性进行分析。结果表明，在红球姜雌性生殖器官授粉后的发育过程中，GAPDH和UBQ的表达稳定性最好，均适合作为内参基因，且同时使用两种作为内参基因能使实时荧光定量PCR标准化分析结果更精确。因此，最终选择GAPDH和UBQ作为实时荧光定量PCR标准化分析红球姜雌性生殖器官相关基因表达的内参基因。本研究将为探究红球姜败育的分子机理奠定基础，也为近源姜属植物内参基因的筛选提供线索。     

鲍幼虫变态分子机制的研究进展

综述了鲍幼虫变态及其分子机制的研究进展.鲍因其幼虫营卵黄营养,且同昆虫和蛙类相比,鲍幼虫变态速度快、存在提早发育(‘anticipatory’developmental program)现象,是研究贝类乃至海洋无脊椎动物变态现象的理想模式.早期研究采用药理学和电生理学方法发现了GABA等能够诱导鲍变态的物质,并且提出了变态过程信号通路,但调节幼虫变态的分子机制仍然所知甚少.研究人员采用差异显示PCR和基因芯片等手段获得了一些变态前后差异表达的基因.但是变态是由众多的基因和信号分子共同决定和影响的.传统获得差异基因的方法效率低、获得基因数量少、受公布的EST(表达序列标签)限制大,所以调控变态的分子网络和机制还尚未建立,缺乏对调控这一细胞过程的整体认识.转录组学分析获得大量变态差异基因,并且有助于建立差异基因相互作用网络,是研究变态分子机制的新方向.此外,变态差异基因的功能验证和注释是鲍变态分子机制研究的另一问题,基因干扰可能是解决方向之一.     

18S rRNA作为植物实时荧光定量PCR内参基因的探究

实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)已广泛用于基因表达分析,而内参基因的选择对qRT-PCR定量分析的数据校正起关键作用.以18S rRNA作为小麦、苜蓿和杜鹃qRT-PCR的内参基因,探究其表达丰度是否适合作为这3种植物的内参基因.结果表明18S rRNA在这3种植物中的表达丰度均过高,Ct值均小于15,影响目的基因定量的准确性.因此,在目的基因的表达量低时,18S rRNA不宜作为这3种植物的内参基因.     

铁蛋白重链多肽对RAW264.7细胞中凋亡相关基因表达的影响

为了探讨铁蛋白重链多肽(ferritin heavy chain 1,FTH1)对RAW264.7细胞中凋亡相关基因表达的影响,采用RNA干扰和实时定量方法进行研究,首先提取RAW264.7细胞的总RNA,应用反转录PCR获得定量片段,制定标准曲线。将pSIREN-FTH1A/B转染到RAW264.7细胞,48 h后用绵羊种布鲁氏菌019株侵染4 h,实时定量PCR检测凋亡相关基因Mkl1、Birclb的表达,GAPDH作为内参基因,检测干扰前后凋亡相关基因mRNA的量。结果显示:转染pSIREN-FTH1的细胞被布鲁氏菌侵染后,Mkl1、Birclb基因mRNA的量较干扰前分别降低了76.3%、88.8%。FTH1可调节凋亡相关基因表达从而影响细胞凋亡的进程。     

藜麦内参基因筛选及盐胁迫相关基因表达分析

为了利用实时荧光定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)分析藜麦(Chenopodium quinoa Willd)相关基因表达,提高结果的准确性,筛选出稳定表达的内参基因至关重要.我们分别利用geNorm、NormFinder和Bestkeeper程序分析了6个藜麦候选内参基因在NaCl胁迫下表达的稳定性,并用实时荧光定量PCR技术对藜麦盐胁迫相关基因P5CS1和CMO基因相对表达量进行分析.结果表明,藜麦在NaCl胁迫下ACT-1和TUB-6做为内参基因表达最稳定,为最佳内参基因;藜麦P5CS1基因表达水平上调6倍左右,CMO基因上调30～40倍.本研究为NaCl胁迫下藜麦基因表达分析提供了可靠的内参基因,并且对NaCl胁迫下P5CS1和CMO基因表达情况做出初步分析.     

扩展青霉菌实时定量PCR内参基因挖掘与应用

实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术因其高效且便捷的特点在基因表达检测中被广泛应用。实时定量PCR结果数据处理策略之一是使用内参基因进行基因表达数据的标准化。文章基于扩展青霉菌孢子不同生长阶段的RNA-seq数据，挖掘和注释了694个稳定表达的候选内参基因；随机挑选出Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase在内的14个基因，以4、25℃条件下PDB培养基生长6、12、24、36 h的扩展青霉菌为材料，进行实时定量PCR实验。实时定量PCR数据基于geNorm和NormFinder 2种软件的综合分析，表明Isy1、Spt5、Nucb、Hp1适合作为内参基因。以Isy1和Spt5分别作为内参基因，检测Gh30基因在4、25℃条件下扩展青霉菌生长发育过程中的基因表达，显示出一致的基因表达水平，进一步验证了挖掘得到的内参基因的可靠性。该研究为扩展青霉菌的分子生物学研究提供了优良的内参基因，同时提供了一种高效的内参基因的挖掘和鉴定方法。     

工业大麻种子萌发及渗透胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选适用于工业大麻种子正常萌发与渗透胁迫下萌发的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)内参基因,研究以‘云麻7号’种子为试验材料,设置正常萌发和20%PEG渗透胁迫下萌发处理.利用qRT-PCR技术对10个候选参考基因（CDPK,e IF4E,TIP41,UBQ,EF1α,PP2A,Actin,Clathrin,TUB,DHS2）在3个萌发时间点（萌发3、5、7 d）幼苗中的表达量进行检测.通过GeNorm、Normfinder和BestKeeper三种软件包对内参基因表达稳定性进行评价,再利用RefFinder在线软件进行综合分析,从而获得稳定、适宜的内参基因.结果表明,在工业大麻种子正常萌发过程中,PP2A基因的稳定性最好.在渗透胁迫下的种子萌发中,UBQ基因的稳定性最好.综合两组结果得出,eIF4E内参基因的表达最稳定.研究结果确定了工业大麻种子萌发及渗透胁迫下进行qRT-PCR分析的最适内参基因,为今后研究工业大麻种子萌发响应渗透胁迫相关基因的表达提供前期基础.     

小苍兰实时荧光定量PCR中的内参基因筛选

筛选适用于小苍兰实时荧光定量PCR的内参基因，为准确研究小苍兰基因表达，尤其是种球发育相关基因的表达分析提供参考。     

节旋藻实时荧光定量PCR内参基因的选择

本实验利用实时荧光定量PCR对极大节选藻中16SrRNA、TEF(翻译延伸因子,GTPases)、RPL13(核糖体蛋白)、PSR(藻蓝蛋白β亚基)、CYP(亲环素家族)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、Hsp(热休克蛋白)和rpoD(RNA聚合酶σ70因子)八个候选基因在正常生长和持续光照条件下的稳定性进行了检测。用geNorm软件对实验数据进行处理,从中选出合适的内参基因。结果表明RPL13和CYP38可以作为正常生长和持续光照处理下极大节选藻节律性研究通用的内参基因16SrRNA基因的稳定性要低于其他的候选内参基因,并不是一个合适的内参基因。     

六溴环十二烷胁迫下红树蚬荧光定量PCR内参基因稳定性分析

【目的】筛选出不同浓度六溴环十二烷(HBCD)胁迫下红树蚬(Polymesoda erosa)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的最适内参基因,用以准确校准目的基因的表达,为进一步开展分子毒理研究和开发分子生物标志物奠定基础。【方法】通过荧光定量PCR技术监测候选内参18S核糖体RNA(18S rRNA)、β-肌动蛋白(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、α-微管蛋白(α-tubulin)等管家基因,在红树蚬各组织受不同浓度(0μg/L、0.86μg/L、8.6μg/L)六溴环十二烷(HBCD)胁迫后的表达量,利用qRT-PCR及geNorm、NormFinder、BestKeeper等分析软件对不同条件下的表达数据进行处理,从而筛选出适合荧光定量PCR的最佳内参基因。【结果】受不同浓度HBCD胁迫后,鳃及肝胰中各管家基因的表达稳定性排序整体为β-actin=α-tubulinGAPDH18S rRNA。【结论】可单独或共同使用两个内参基因(β-actin、α-tubulin)校准荧光定量结果。     

青海茄参不同部位内参基因表达稳定性分析

为探究青海茄参不同部位稳定表达的内参基因,本研究以青海茄参根、茎、成熟果实及成熟叶片为试验材料,选取6个内参基因(Actin7-NT、18S rRNA、TUA、ELF4、ELF6和GAPCP2),采用实时荧光定量qRT-PCR技术,并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt及RefFinder 5种方法分析候选内参基因的表达稳定性,筛选青海茄参中稳定性最佳的内参基因。结果表明：18S rRNA为青海茄参根及成熟叶片中最佳稳定内参基因,ELF4为青海茄参茎及成熟果实中最稳定的内参基因。综合分析结果为青海茄参不同组织中表达最稳定的内参基因是Actin7-NT,该结果可为后续挖掘青海茄参相关基因及代谢、蛋白等功能分析提供理论依据。     

多氯联苯胁迫下红树蚬荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出多氯联苯(PCBs)胁迫下红树蚬(Polymesoda erosa)的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)最适内参基因,为进一步开展分子毒理学研究奠定基础。【方法】以β?actin、18S rRNA、GAPDH和#?tubulin为候选内参基因,qRT-PCR测定PCBs胁迫下4个候选内参基因在红树蚬外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺组织中的表达水平,应用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析其表达稳定性。【结果】geNorm软件分析表明β?actin表达最稳定;NormFinder软件分析发现,外套膜、鳃和肝胰腺组织中β?actin的稳定性最好,闭壳肌组织中β?actin(0.454)表达稳定性略微低于#?tubulin(0.425),排第2位;BestKeeper软件分析表明,外套膜和鳃组织中β?actin最稳定,肝胰腺和闭壳肌组织中GAPDH最稳定,β?actin排位第2位。【结论】筛选β?actin为红树蚬在PCBs胁迫下的qRT-PCR最适内参基因。     

鸭β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中鸭β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR G reen I染料建立了荧光定量PCR法(real-tim e PCR).以PCR产物建立标准曲线,C t值线性范围为12.2~35.1,相关系数为0.996;熔解曲线分析显示产物为单特异峰,Tm为86.5±0℃.本实验建立的鸭β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、线性范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸭功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

H1N1猪流感病毒感染猪血管内皮细胞后内参基因的筛选

旨在评价H1N1猪流感病毒感染猪血管内皮细胞(PUVEC)后,肽基脯氨酰异构酶A(Ppia)、β-肌动蛋白(Actb)、核糖体蛋白L4(Rpl4)、酪氨酸3/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白(Ywhaz)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)等5个内参基因的稳定性.采用Real-time RT-PCR方法测定H1N1 SIV感染PUVEC后3、6、9、12、15、18、24和30h时5个内参基因mRNA的表达水平,未感染PUVEC为对照,采用2-△Ct值对内参基因进行相对定量,应用Genorm软件对其稳定性进行评价.结果表明,5个内参基因的稳定性由高到低分别为Ppia和Rpl4、Ywhaz、Actb、Gapdh,其中Ppia和Rp14稳定性相同.据此可知,Ppia和Rpl4在所选的5个内参基因中是研究H1N1 SIV与机体互作理想的2个内参基因.     

高粱BTx623幼苗多酚氧化酶Real-time PCR引物扩增效率的检测

介绍了一种检测实时荧光定量PCR技术引物扩增效率的方法,以期为进一步应用实时荧光定量PCR奠定基础。同时通过实时荧光定量PCR技术,研究高粱BTx623幼苗中的多酚氧化酶基因SbPPO的表达情况,结果发现SbPPO2,SbPPO5,SbPPO6的相对表达量较高,这3个SbPPO可能在高粱BTx623幼苗中起到重要功能。     

意大利蜜蜂AmCht11基因的克隆鉴定和发育时期表达分析

【目的】克隆鉴定和定量PCR组织表达分析意大利蜜蜂(Apis mellifera)几丁质酶AmCht11基因。【方法】克隆测序鉴定AmCht11基因序列,通过多重序列比对分析该基因编码的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测AmCht11蛋白的二级结构、三级结构以及相互作用靶蛋白,构建系统进化树分析该蛋白在几丁质酶家族中的分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCht11基因的组织表达特征。【结果】AmCht11基因cDNA序列全长1404bp,编码468个氨基酸;预测AmCht11蛋白质相对分子质量为53.5kDa,等电点为7.21。多重序列比对和系统进化分析表明,AmCht11蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅷ亚家族成员,该蛋白的氨基酸序列N-端含有跨膜域,具典型的几丁质酶催化结构域,无结合结构域,也不具信号肽。进一步实时定量PCR分析表明,AmCht11基因表达量在意大利蜜蜂幼虫发育第2至第5日龄无明显波动,至幼虫后期第6日龄表达量明显上调。【结论】推测AmCht11基因与意大利蜜蜂幼虫发育后期的蜕皮有关。
     

FTH1在布鲁氏菌侵染宿主细胞中的作用

为了探究布鲁氏菌侵染宿主巨噬细胞过程中铁蛋白(FTH1)生物学功能,本研究根据FTH1蛋白核苷酸序列,分别设计4条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体,并转染RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR筛选干扰效果最优的质粒;布鲁氏菌侵染干扰前、后的RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR检测布鲁氏菌基因16S rRNA和细胞凋亡相关基因的mRNA表达量。结果显示:获得了4条特异性siRNA分子,经测序正确,pSIREN-C siRNA质粒对FTH1干扰效果最高可达98%。干扰后布鲁氏菌侵染抑制率为84%,凋亡相关基因的mRNA表达量5个降低,3个上升。本研究表明:FTH1基因沉默后布鲁氏菌胞内的生存能力下降;布鲁氏菌侵染可以抑制细胞凋亡发生,FTH1基因沉默后细胞凋亡升高。     

大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因（rps15A）的克隆及序列分析

根据已报道的部分物种的核糖体蛋白S15A亚基基因(rps15A)的相关信息设计引物, 运用RTPCR和TouchdownPCR技术, 分别克隆了大熊猫核糖体蛋白S15A亚基的cDNA和结构基因序列, 并进行测序及分析. 结果表明: 大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因的表达序列全长为460 bp,开放阅读框(ORF)为393 bp, 编码130个氨基酸, 结构基因序列全长为6091 bp, 含有4个外显子和3个内含子. RPS15A蛋白的相对分子质量为14.84 kD, pI为10.62. 拓扑预测显示含有5个类型的功能位点, 即: 1个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 2个蛋白激酶C磷酸化位点, 1个乙酰化位点, 1个N 糖基化位点及1个核糖体蛋白S8 signature位点. 进一步对RPS15A蛋白的结构分析及其与部分脊椎动物和果蝇RPS15A蛋白的同源性分析, 发现该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性, 这表明真核生物核糖体蛋白亚基S15A在进化中具有较高的保守性.     

意大利蜜蜂AmCht11基因的克隆鉴定和发育时期表达分析

【目的】克隆鉴定和定量PCR分析不同发育时期意大利蜜蜂(Apis mellifera)几丁质酶AmCht11基因。【方法】克隆测序鉴定AmCht11基因序列,通过多重序列比对分析该基因编码的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测AmCht11蛋白的二级结构、三级结构以及相互作用靶蛋白,构建系统进化树分析该蛋白在几丁质酶家族中的分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCht11基因的组织表达特征。【结果】AmCht11基因c DNA序列全长1 404 bp,编码468个氨基酸;预测AmCht11蛋白质相对分子质量为53.5 k Da,等电点为7.21。多重序列比对和系统进化分析表明,AmCht11蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅷ亚家族成员,该蛋白的氨基酸序列N-端含有跨膜域,具典型的几丁质酶催化结构域,无结合结构域,也不具信号肽。进一步实时定量PCR分析表明,AmCht11基因表达量在意大利蜜蜂幼虫发育第2至第5日龄无明显波动,至幼虫后期第6日龄表达量明显上调。【结论】推测AmCht11基因与意大利蜜蜂幼虫发育后期的蜕皮有关。