UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5酶活性及酶反应动力学分析

运用PCR扩增获得了属于尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)家族UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5的cDNA序列,构建了三种基因的GST融合表达载体,使用大肠杆菌对三种基因进行原核表达,从裂解液上清中获得具有活性的目的蛋白.分别以ABA、对氨基苯甲酸作为反应底物,通过高效液相色谱法,测定三种蛋白的酶活力.结果发现除了UGT75B1对对氨基苯甲酸表现出很高的活性以外,另外两种蛋白仅表现出了低水平的活性.三种蛋白对ABA都表现出了活性,UGT71B6具有最高的酶活力.对UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5三种蛋白对ABA的作用进行了体外酶反应动力学分析,测定出它们的Km值分别为:0.73、0.43和0.45mM.以上结果说明UGT75B1对对氨基苯甲酸的活性明显高于ABA,对氨基苯甲酸是其专一底物.UGT71B6和UGT71C5对ABA都有较高的活性,两者Km值差距不大.     

酶活性及酶反应动力学分析

运用PCR扩增获得了属于尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)家族UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5的cDNA序列, 构建了三种基因的GST融合表达载体, 使用大肠杆菌对三种基因进行原核表达, 从裂解液上清中获得具有活性的目的蛋白.分别以ABA、对氨基苯甲酸作为反应底物, 通过高效液相色谱法, 测定三种蛋白的酶活力.结果发现除了UGT75B1对对氨基苯甲酸表现出很高的活性以外, 另外两种蛋白仅表现出了低水平的活性.三种蛋白对ABA都表现出了活性, UGT71B6具有最高的酶活力.对UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5三种蛋白对ABA的作用进行了体外酶反应动力学分析, 测定出它们的Km值分别为: 0.73、0.43和0.45mM.以上结果说明UGT75B1对对氨基苯甲酸的活性明显高于ABA, 对氨基苯甲酸是其专一底物.UGT71B6和UGT71C5对ABA都有较高的活性, 两者Km值差距不大.     

拟南芥ABA受体与UGT71B6的相互作用研究

为进一步分析ABA尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶UGT71B6参与植物抗逆反应的具体机制,本研究通过体外酵母双杂交实验与GST-Pull down实验、体内双分子荧光互补实验(BIFC)分析了ABA受体RCARs与UGT71B6之间的相互作用关系.实验结果显示ABA受体RCAR12、RCAR13与UGT71B6,在体内、体外均存在直接的相互作用.研究表明UGT71B6的生理功能与ABA受体之间存在重要联系, UGT71B6可能通过ABA受体的介导参与了植物逆境应答反应.实验结果也为初步探究ABA受体是否参与ABA稳态调节过程提供一定参考.     

右旋甲状腺素对Ⅱ相代谢酶UGT2B17抑制的研究

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)主要参与体内多种物质代谢,是人体内最重要的Ⅱ相代谢酶. UGT2B17是UGTs的一种亚型,当UGT2B17的活性被抑制,其代谢的多种内源性和外源性物质在体内蓄积,产生相应的毒副作用.本实验建立经典的体外孵育体系,采用4-甲基伞形酮(4-MU)作为反应底物,测得右旋甲状腺素存在的情况下,UGT2B17对4-MU代谢的残余活性小于20%,后续实验测得抑制动力学参数Ki值为0.064 μmol/L.所以右旋甲状腺素对UGT2B17的活性有强烈的抑制作用.因此在临床中应用含右旋甲状腺素的药物时应注意其剂量,避免引起其对UGT2B17活性的抑制,导致毒副作用.     

结构修饰的穿心莲对UGT2B7抑制能力的评价

临床上穿心莲大多应用于治疗呼吸系统疾病、心血管系统疾病和胃肠道系统疾病等.现今,临床上多存在同时使用两种甚至两种以上的药物,引起体内代谢酶UGTs的代谢抑制,从而引发药物-药物相互作用.本实验主要研究由实验室合成的穿心莲内酯化合物A:zfx-45-7对UGT2B7酶的抑制作用,采用4-甲基伞形酮(4-MU)葡萄糖醛酸化抑制法,以4-MU作为底物对UGT2B7代谢穿心莲化合物的抑制能力做了初步的筛查,测得其残余活性小于20%,继续实验测定抑制常数K_1值为0.15μm0l/L,从而为进一步合成穿心莲药物做出理论和基础实验准备.     

拟南芥糖基转移酶基因UGT71C5启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆到长度为903 bp的UGT71C5基因启动子,并构建了此种启动子与GUS嵌合的重组载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,得到转基因拟南芥,并且通过启动子分析软件对全序列进行分析,发现在该段序列中含有典型的TATA-box、CAAT-box和光应答元件GT1、干旱应答元件ERD等一些顺式作用元件.利用分光光度法测定转基因植株在光照、干旱和ABA等胁迫处理下的GUS酶活力,结果表明：转基因植株的GUS酶活力介于野生型和35S阳性对照之间,与正常条件下生长的转基因植物相比,光照处理     

右旋甲状腺素对Ⅱ相代谢酶UGT2B7抑制的研究

临床上应用甲状腺片治疗甲状腺疾病,甲状腺片中含有左旋甲状腺素和右旋甲状腺素,临床发现甲状腺片会影响其他药物的作用,本实验主要研究右旋甲状腺素对UGT2B7的抑制作用.采用4-甲基伞形酮(4-MU)作为底物,测得有右旋甲状腺素存在的情况下,UGT2B7对4-MU代谢的残余活性小于20%,后续实验测得抑制动力学参数Ki值为20.46μmol/L.说明右旋甲状腺素对UGT2B7的活性有强烈的抑制作用.所以临床中应用含有右旋甲状腺素的药物时,应限制用药的剂量,避免引起药物-药物相互作用.     

筛选EV71 3C蛋白酶切割的宿主细胞蛋白

肠道病毒EV71 型是引起儿童手足口病的主要病原体,3C 是其编码的蛋白酶之一.3C 在切割病毒前体蛋白为成熟蛋白的同时,切割一些具有重要功能的细胞蛋白,影响细胞的生理功能. 为进一步了解EV71 与宿主的关系,明确EV71 致病机制的细节,在前期以3C 蛋白为诱饵开展的酵母双杂交工作的基础上,选取了5 种细胞蛋白,分析其是否是3C 蛋白可能的切割底物. 发现ZMYM2 蛋白可以被3C 切割;这一切割效应是依赖3C 蛋白酶活性的特异性切割,无需RNA 介导. 上述发现为进一步揭示EV71 致病机制提供了线索.     

真核表达肝药酶UGT1A9可溶重组蛋白方法探索

UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)是人体重要的肝脏药物代谢酶,其底物选择性、催化机制等研究因难以获得可溶性全酶而受到限制.本研究以制备UGT1A9可溶重组蛋白为研究目标,通过筛选重组蛋白表达体系、融合标签种类及linker长度,优化重组蛋白表达纯化条件和方法,实现了重组UGT1A9的大量制备.HEK293F细胞分泌表达的His₈-MBP-NSAS-UGT1A9(氨基酸25-466)重组蛋白经Ni-TED亲和纯化介质从培养基上清液中分离,洗脱产物经SDS-PAGE、Western blot及MS检测鉴定为目的蛋白,通过Bradford法测得重组蛋白最终产量为2 mg/L,纯度达到95%以上.本研究建立了一种人源药物代谢酶UGT1A9的可溶重组蛋白表达纯化方法,为UGT1A9及UGTs同工酶的药物代谢、催化机制及结构解析研究奠定基础.     

肺炎衣原体中4-羟基苯甲酸脱羧酶的活性

来源于肺炎衣原体AR 39的蛋白质NP_444977其功能未知,但BLA ST分析表明此蛋白质可能具有4-羟基苯甲酸脱羧酶的活性。因此,在大肠杆菌BL 21(DE 3)中诱导表达此蛋白并进行纯化,从而完成酶促反应的分析。结果表明,该蛋白能够催化4-羟基苯甲酸转化为苯酚,证明此蛋白具有4-羟基苯甲酸脱羧酶的活性。金属离子M g2 、F e2 和C a2 能够增强酶活性,但Cu2 和Zn2 却对酶活无影响。酶促反应中最适的pH及温度分别为7.5和30℃。在最适的pH 7.5和30℃的条件下,蛋白质的米氏常数Km为40.1 mm o l/L。蛋白质还具有底物识别的特异性,能够催化3,4-二羟基苯甲酸转化为邻苯二酚,而不能催化2,4-二羟基苯甲酸转化为间苯二酚,这表明苯环上3′位的配基对酶活无影响。     

聚甲基丙烯酸缩水甘油酯固定化青霉素酰化酶性质的研究

应用反相悬浮技术合成了珠状甲基丙烯酸缩水甘油酯 - N ,N′-亚甲基双 (丙烯酰胺 )共聚物 ,并将巨大芽孢杆菌 ( Bacillus megaterium)青霉素酰化酶共价偶联到甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物载体上 ,制成固定化青霉素酰化酶 ,其表观活性为 3 71 U/g(干重 ) ,水解青霉素 G钾盐的最适温度为 47°C,最适 p H为 8.5 ,在 p H4.5～ 9.0 ,温度 40°C以下时酶的活性稳定 ,表观米氏常数 Km为 1 .3 3× 1 0 -2 mol/L ,最大反应速度 vmax为 1 .2 7× 1 0 -5mol/min,固定化酶在 4°C冰箱保存 3 5 d,再水解 w=0 .0 2的青霉素 G钾盐溶液 ,重复使用 3 0次 ,保留酶活性 88.1 %。     

大肠杆菌氨基转移酶的非天然氨基酸底物特异性研究

氨基转移酶催化L-氨基酸和α-酮酸之间的氨基转移.TLC(薄层层析)和甲臜颜色反应检测大肠杆菌4种氨基转移酶(TyrAT、IlvAT、AspAT和AvtAT)催化6种非天然氨基酸的转氨活性,发现AvtAT和AspAT无非天然氨基酸转氨活性. TyrAT能催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正缬氨酸的转氨反应,而IlvAT则催化DL-高苯丙氨酸、L-正缬氨酸、L-正亮氨酸、L-叔亮氨酸和L-新戊基甘氨酸的氨基转移.使用易错PCR突变和DL-高苯丙氨酸/L-正亮氨酸作氮源定向进化筛选,获得10个不同位点突变的TyrAT突变酶.酶活分析发现,这些突变酶虽酶活不同但尚未扩展TyrAT的非天然氨基酸底物特异性.10个突变酶中,每个酶蛋白210位都出现Cys替换Phe.与野生型酶比较,TyrAT的F210C突变明显改变酶的催化最适温度并且提高酶在37℃的催化效率.     

人源蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B功能域及其全酶的原核表达及活性比较

通过设计引物,利用RT-PCR从人肝癌细胞(huh-7)中克隆蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)全长及功能域PTPc的cDNA序列并连接到pGEM-T Vector载体上,测序正确的cDNA序列连接到表达载体pET-32a(+)上,分别在大肠杆菌Transetta(DE3)和BL21(DE3)菌株中稳定表达目标蛋白,经Ni 2+亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯,通过酶促动力学方法分析两种蛋白的体外活性.本实验成功表达了PTP1B和PTPc可溶性蛋白,并发现Transetta(DE3)菌株较BL21(DE3)有更高的蛋白表达能力;酶促动力学分析表明,PTP1B全酶的Vmax为16.13mmol·L-1·s-1,Km为0.94mmol/L;其功能域PTPc的Vmax为5.49mmol·L-1·s-1,Km为0.54mmol/L.表明PTP1B全酶的活性高于PTPc功能域的活性.     

人鼻病毒3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

人鼻病毒3C蛋白酶具有高特异性,且在低温条件下具有较高酶活,目前已被商品化.在大肠杆菌中利用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签可促进人鼻病毒3C蛋白酶的可溶性表达.将人鼻病毒3C蛋白酶的DNA编码序列克隆到pRK792载体上,然后导入到大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,获得MBP-LEVLFQGP-6x His-人鼻病毒3C蛋白酶融合蛋白,随后通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白.用该产物切割纯化的MBP-LEVLFQGP-6x His-木聚糖酶融合蛋白,可获得木聚糖酶并用底物平板检测其活性.实验结果表明人鼻病毒3C蛋白酶能够在大肠杆菌中表达,并且能特异性地在其底物识别序列进行切割,从而移除MBP标签,获得仅带有6x His的人鼻病毒3C蛋白酶.该酶可以特异性地去除木聚糖酶融合蛋白中的MBP标签,获得有活性的木聚糖酶.利用MBP标签能够促进人鼻病毒3C蛋白酶可溶性表达,且人鼻病毒3C蛋白酶的活性不受影响,有利于一些不稳定的蛋白在低温下的标签去除和纯化.     

鲢鱼副产物蛋白质酶解条件的优化

本文以鲢鱼副产物中蛋白质为酶解底物,采用三因素二次旋转下交回归设计,研究水反应中酶-底物浓度经（[S]/[S]）PH,温度（T）三个因素对蛋白回收率的影响,得出最优水解条件为[E]/[E]=3.33%.PH=8.54.T=58C,蛋白回收率>75%.     

茂金属/烷基铝/B(C6F5)3催化体系催化乙烯聚合

Cp2ZrCl2、Et(Ind)：ZrCl2与烷基铝原位生成二烷基化茂金属．然后与B(C6F5)3作用组成新的催化体系，研究了这种催化体系对乙烯聚合的影响、发现用三乙基铝的体系对乙烯聚合没有活性，用三异丁基铝的体系对乙烯聚合有较高活性，其原因在于形成了不同的活性中心，用紫外光谱的方法研究活性中心的结构及其变化，并与聚合活性进行了关联。     

牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定

用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.     

尿激酶B链的制备及性质研究

本文将巯基乙醇还原法与苯甲脒-Sepharose 4B亲和层析法相结合,于亲和柱上裂解了尿激酶蛋白的A、B链,制备出高纯度的尿激酶B链,活力回收达89.3％。样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为均一单带,测得分子量为32KD,比活为214×10~3iu/mg蛋白,活性的最适pH为8.0。在体外测活系统中,尿激酶B链有类似于尿激酶的性质。若以纤维蛋白溶酶原为底物,测得B链的Km值为尿激酶的3.2倍。由此推测,天然形成的尿激酶结构更有利于纤溶反应。     

一种Tb（Ⅲ）配合物的合成、结构及发光性能研究

采用水热合成方法,以对硝基苯甲酸为配体,合成了1种具有1D链状结构的Tb（Ⅲ）配合物[Tb2（C7H4NO4）6（H2O）4.H2O]n,通过X-射线单晶衍射确定了该配合物的晶体结构.结构分析表明,该配合物属三斜晶系,P-1空间群,配合物的不对称单元中包含2个不等效的Tb（Ⅲ）离子,Tb1为8配位,Tb2为9配位.在晶体中,Tb（Ⅲ）离子被对硝基苯甲酸根连成1D链状结构,其中,对硝基苯甲酸根采取3种配位模式,即螯合双齿,桥联双齿,桥联三齿.而1D链之间又通过3种类型的O—H…O氢键被连成2D氢键网络结构.在室温下,测定了该配合物晶体粉末的IR（红外）、UV-Vis-NIR（紫外-可见-近红外）吸收光谱以及荧光激发和发射光谱.光物理研究表明,该配合物在可见光的激发下（λEx=488nm）,表现出较强的Tb（Ⅲ）的特征发射,这主要归功于配体的敏化作用.     

熊猫豆β—D—半乳糖苷酶的基本性质研究

经硫酸铵分级分离,DEAE－cellulose 52,CM-cellulose 52和Sephacryl S 100HR凝胶过滤层析方法从熊猫豆黄化苗中获得了一种β－D－半乳糖苷酶,活性收率为8．0％,纯化倍数为245。经PAGE显示单一蛋白着色带,用IEF－PAGE测定其PI为4．1。SES－PAGE显示2条蛋白着色带,其相应分子量分别为40kD和29kD.Sephadex G200层析法测得表观分子量为68kD,以ONPG和PNPG为底物测得该酶的表观Km分别为3.02mmol/L和0．33mmol/L。最适pH为4．2,最适温度为52℃。以乳糖为底物测得表观Km为43mmol/L.HgCI2,DTNB,NEMI,半乳糖和乳糖对酶表现出不同的抑制作用。对某些金属离子和化学修饰剂对酶活性的影响也进行了探讨。