从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究

从血液中提取基因组DNA的传统方法是先得到淋巴细胞,再用蛋白酶K、SDS消化,然后用酚、氯仿抽提,乙醇沉淀．CTAB法提取基因组DNA多应用于植物和微生物,从全血中提取基因组DNA报道甚少．采用改良的CTAB法从全血中提取基因组DNA,并以传统方法和TAKARA Blood Genome DNA Extraction Kit作对照．结果表明：CTAB法可以得到大量的、较完整的基因组DNA,并且纯度达到1．8～2．0,可以满足PCR扩增和限制酶切等实验的要求．     

琼脂糖电泳凝胶中回收微量DNA片段的新方法

对现有的DNA片段回收方法进行了改进.琼脂糖凝胶中目的DNA片段条带切割后,浸入适量的TE溶液(0.2～0.4 mL/g 琼脂糖胶),在37 ℃水浴保温15 min,以溶出凝胶中的DNA,利用相应的引物对浸出的微量DNA样品进行与原PCR反应相同条件下的PCR扩增,直接用75 %乙醇沉淀后,适量TE溶解得到回收的目的DNA样品.此法回收的DNA片段可用于分子克隆,特别是适用于TA载体的克隆与测序,适合大批量微量样品的准确回收,防止了因试剂盒回收造成的微量DNA片段的丢失.     

体外培养瘤胃微生物总DNA的提取与纯化

主要目的是寻找一种能最大限度获取所有类型的瘤胃微生物大片段DNA的提取方法,为后期分子生物学技术研究瘤胃微生物奠定基础。采用液氮冻融+溶菌酶+CTAB和SDS相结合的方法处理瘤胃样品并充分破壁,再采用酚/氯仿/异戊醇抽提、异丙醇沉淀获得DNA粗提物,经过试剂盒纯化后得到瘤胃微生物DNA样品。经特异性引物PCR检测,本方法所提取的DNA包含细菌、古细菌、真菌及原虫四类微生物信息。因此,采用该方法提取的DNA可用于后期实时定量PCR或DGGE等研究。     

柳毒蛾核型多角体病毒内蒙株(LsNPV-IM)DNA的限制性内切酶谱分析

将柳毒蛾核型多角体悬液降解 ,降解产物经 Tris-饱和酚和氯仿抽提 ,乙醇沉淀分离出Ls NPV-DNA.用限制性内切酶 Pst ,Hind ,Pst /Hind ,Hind /Eco R 和 Pst /Bam H 单酶切或双酶切 .经琼脂糖凝胶电泳并对其结果进行分析 ,建立了酶切图谱     

唇鱼骨基因组DNA提取与ISSR-PCR的优化

以唇鱼骨为材料,分别采用4种不同方法(CTAB法、SDS法、ROSE法及试剂盒)提取基因组DNA,并对影响PCR反应的模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+、Taq酶浓度等主要因子进行了优化,建立了适合唇鱼骨基因组DNA的ISSR-PCR反应体系.25μL的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:约60 ng模板DNA,1.2 U Taq酶,0.4 μrnol/L引物,2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,2%甲酰胺.结果表明,利用优化反应体系对4种不同方法提取的DNA进行PCR扩增,均能得到较好的PCR扩增条带,以试剂盒法最佳,为淡水溪流性同属鱼类遗传多样性分析奠定了技术基础.     

活性污泥宏基因组DNA提取方法优化

宏基因组DNA的成功获取是宏基因组学技术顺利开展的关键.利用溶菌酶-SDS-蛋白酶K法（LSK法）提取活性污泥宏基因组DNA,结合单因素法与表面响应法对提取过程的4个关键步骤进行条件优化,即预处理、细胞裂解、蛋白去除及DNA沉淀过程.确定影响DNA产量的重要因素：预处理缓冲溶液与DNA沉淀剂类型、CTAB质量分数、溶菌酶浓度、37℃水浴时间及SDS质量分数.确定LSK法提取宏基因组DNA的最佳条件：TENC预处理活性污泥;1.5%CTAB;0.5mg/mL溶菌酶,37℃水浴1.4h;2%SDS,200μg/mL蛋白酶,55℃水浴2.5h;异丙醇沉淀DNA 40min.在最佳条件下,活性污泥宏基因组DNA的最大产量为每g污泥170μg.本研究可为环境样品中高质量宏基因组DNA的提取提供有价值的参考.     

从寄主昆虫血淋巴中分离纯化病原真菌菌体的方法

采用正交实验方法,对东亚飞蝗（Locusta migratoria）血细胞裂解及其DNA和RNA降解的条件进行了优化．在优化条件下,不仅去除了感病东亚飞蝗血淋巴中的血细胞及DNA和RNA。而且成功地分离和纯化了绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌体．裂解血细胞及其DNA和RNA的最佳酶解条件为：蛋白酶K的浓度为1mg／mL,作用温度为26℃,时间为60min,脱氧核糖核酸酶（DNAase I）的用量为5U,核糖核酸酶（RNAaseA）的浓度为0．5mg／mL,作用时间为35min,作用温度为30℃．以蝗虫特异引物进行PCR及RT-PCR检测结果表明,从绿僵菌侵染后的蝗虫血淋巴中分离纯化无蝗虫DNA和RNA污染的绿僵菌菌体,为后续分离和克隆绿僵菌侵入蝗虫体内后表达的基因,研究它们在致病机理中的作用奠定了基础．     

碘化钠法提取牦牛基因组DNA的研究

目的,应用碘化钠法从牦牛全血中快速提取基因组DNA,并检验其效果.方法,使用碘化钠裂解血细胞,氯仿-异戊醇抽提DNA,乙醇沉淀DNA,紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳测定DNA的浓度和纯度.结果,提取DNA纯度的平均值1.58,浓度的平均值58.6 ng/μL,分子量大约23 kb,无RNA污染.结论,NaI法操作方便,所需设备简单,可从牦牛全血中快速抽提得到基因组DNA,但提取DNA的纯度偏低.     

海桐ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对海桐的遗传多样性进行研究,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如退火温度、Mg2 浓度、4×dNTP浓度、牛血清白蛋白浓度、模板DNA用量、引物用量以及Taq DNA聚合酶用量等指标进行优化,建立了可用于海桐ISSR分析最适宜的反应体系:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,2.0 mg/mL牛血清白蛋白,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 U Taq DNA聚合酶.引物UBC807的最适退火温度为50.7℃.     

不同保存方式下金龟甲虫DNA提取方法及28S rDNA序列分析

通过电泳检测和PCR扩增28SrDNA核基因序列的结果,比较了无水乙醇、75%乙醇、针插干制3种金龟甲虫标本的保存方式和SDS-蛋白酶K法、CTAB法、饱和NaCl法3种提取DNA方法.结果显示,SDS-蛋白酶K法、CTAB法提取3种保存方式的标本时,可成功提取DNA并有效扩增目的基因;饱和NaCl法仅能提取无水乙醇保存标本的DNA并扩增目的基因,而75%乙醇保存标本和干制标本的DNA提取和基因扩增均不理想.     

几种枳壳乙醇提取物对酪氨酸酶抑制作用比较

研究了6种中药枳壳乙醇提取物对酪氨酸酶活力的影响．结果表明：6种中药枳壳乙醇提取物对酪氨酸酶活力均有显的抑制作用，除了绿衣枳壳外，其它5种中药枳壳的提取物随着含量的增大，酶活力呈指数下降．测定导致酶活力下降50％的6种中药枳壳提取物含量(JC50)分别为：0．92mg／mL(绿衣枳壳)、0．96mg／mL(陕西枳壳)、1．30mg／mL(红河橙枳壳)、0．44mg／mL(湖南枳壳)、0．41mg／mL(四川枳壳)、和0．70mg／mL(江西枳壳)，上述6种中药枳壳提取物对酪氨酸酶的抑制作用表现为可逆过程．抑制类型均为混合型，分别测定各种枳壳提取物对游离酶抑制抑制常数(K1)和酶-底物络合物抑制常数(Kis)，并加以比较。     

不同方法提取鳗鲡病原茵DNA模板的差异分析

利用吸光值、琼脂糖电泳及PCR差异扩增等指标,对酚一氯仿法、水煮法、碱裂解法3种方法制备的鳗鲡病原菌DNA模板进行了差异分析．结果表明：1）不同方法提取的病原菌模板DNA的浓度、纯度及分子质量大小存在差异,但以这3种方法提取的病原菌DNA为模板,均能成功扩增到细菌16SrD．NA和外膜蛋白的保守序列．其中,酚一氯仿提取的模板DNA浓度较低、纯度较高;水煮法和碱裂解法提取的模板DNA浓度较高、纯度较低．2）电泳显示,3种方法获得的模板DNA扩增出的16SrDNA保守序列条带均一,没有显著差异,但在外膜蛋白保守序列的扩增中却因菌种和模板提取方法的不同而存在差异．     

Enhanced hydrogen production by insertional inactivation of adhE gene in Klebsiella oxytoca HP1

Ethanol is the main byproduct of anaerobic H2-producing fermentation in Klebsiella oxytoca HP1. Two moles of NAD(P)H are consumed to yield one mole of ethanol that may decrease bacterial hydrogen production. In this article the adhE gene that codes for acetaldehyde dehydrogenase was disrupted for the first time. A homologous recombination vector pTA-Str was constructed in which the adhE gene was disrupted by inserting an aminoglycoside-3'-adenyltransferase (aadA) gene. As expected, the vector includes the insertion 5′-adhE-aadA-adhE-3′. The amplified DNA fragment 5′-adhE-aadA-adhE-3′ from pTA-Str was transformed into K. oxytoca HP1 and one recombinant was obtained. PCR analysis of the resulting genomic DNA indicated the appropriate deletion and insertion. Compared with the H2-production of wild type K. oxytoca HP1, the hydrogen yield of the mutant increased by 16.07% and ethanol concentration decreased by 77.47%, suggesting that inactivation of the adhE gene in K. oxy- toca HP1 is a potential method for enhancing bacterial H2-production.     

B病毒PCR检测方法的建立

目的建立B病毒核酸的PCR检测方法。方法设计引物,用PCR方法扩增B病毒,并验证其灵敏性和特异性。结果引物P1、P2及P3、P4在以B病毒为模板时有特定大小的目的片段出现,在以其他病毒为模板时无目的片段出现;引物P5、P6以B病毒和人单纯疱疹病毒I型(HSVI)为模板能扩增出382bp的产物,经SacⅡ酶切后,B病毒产生176bp和206bp的两个片段,HSVI无变化。结论通过PCR方法成功的区分开B病毒,并且鉴定区分了B病毒和HSVI。     

一种适用于绿僵菌克隆筛选的DNA批量快速提取方法

基因组DNA的提取是最基本的分子生物学实验技术,介绍了一种适用于绿僵菌克隆筛选的DNA批量快速提取方法.研究结果表明:使用改良的察氏琼脂培养基(CDA)代替常用的土豆葡萄糖琼脂(PDA)培养绿僵菌,以钢珠振打破碎菌丝,配以简化的酚氯仿抽提操作,可以高效地提取高质量的真菌基因组DNA.本方法中,CDA菌落生长需2～3 d,双样品提取耗时约15 min,每个菌落可获得DNA数百纳克,片段长度在10 kb左右,电泳条带清晰可见.     

松花粉的抗氧化作用

先对松花粉进行脱油、水提、冻干,获得水提物冻干品,再与缺陷型大肠杆菌菌液进行混合,稀释至终质量浓度为0.5,1.0,2.0mg/mL,喂食模式生物秀丽隐杆线虫(线虫).通过测定线虫的寿命、产卵、吞咽及运动能力,确定松花粉水提物对线虫无明显毒性作用;通过10mmol/L过氧化氢体外氧化压力诱导线虫,确定0.5,1.0,2.0mg/mL松花粉水提物对线虫体外氧化压力有显著保护作用.     

龙脑樟枝叶的龙脑组成特点研究

利用GC-MS法检测干燥龙脑樟枝叶中的龙脑组成特点。龙脑樟的树叶与末端细枝直接用索氏提取法提取,粗枝分解成粗枝枝皮和粗枝木质部后进行提取,提取溶剂为乙醇,粗枝枝皮、粗枝木质部、末端枝条与树叶四种部位的乙醇粗提物得率分别为6.13 %、4.00 %、4.96 %和7.08%。四种粗提物分别配制成1mg·mL^-1甲醇溶液进行GC-MS检测,检出组分数分别为:22,33,30,31,其中龙脑的质量分数分别为50.62 %、24.65 %、48.65 %和70.17 %。结果表明,龙脑樟叶片中龙脑含量最高,粗枝枝皮次之,末端枝条第三,粗枝木质部最低,工业生产宜选取树叶为原料。     

金银花对RNA病毒蛋白酶活性的影响

基于分子对接和实验验证分析金银花不同溶剂提取物及主要成分抗RNA病毒蛋白酶的活性。利用TCMSP(traditional Chinese medicine systems pharmacology)构建金银花小分子配体库,采用药物分子设计模拟SYBYL 2.1.1软件分析金银花与HIV-1蛋白酶和Cathepsin L蛋白酶结合情况。通过荧光法验证金银花不同溶剂提取物(水提物、30%醇提物、60%醇提物和85%醇提物)抗HIV-1和Cathepsin L蛋白酶的活性。收集金银花22个化学成分,其中21个活性成分与HIV-1蛋白酶有较好的结合,金银花抗HIV-1蛋白酶活性强于Cathepsin L蛋白酶。金银花水提物、30%醇提物、60%醇提物和85%醇提物具有抗HIV-1的活性,IC₅₀分别为0.14、0.015、0.05、0.121 mg/mL,其中30%醇提物具有较好的抗HIV-1的活性。金银花不同溶剂提取物未发现有强烈抑制组织蛋白酶的活性,实验结果和计算机筛选结果具有一致性。初步明确金银花抗HIV-1蛋白酶和Cathepsin L蛋白酶活性,为抗病毒药物的开...     

单壁碳纳米管对长片段聚合酶链式反应(PCR)增效机理的初步研究

为了开发新型基因扩增技术,采用两步PCR(two-step PCR)和rpsL保真度实验等方法,对单壁碳纳米管(single-wall carbon nanotube,SWCNT)在长片段PCR反应中的增效机理进行研究.结果表明:在长片段PCR反应中,单壁碳纳米管最适工作质量浓度为0.8,mg/mL;单壁碳纳米管可以在较短的延伸时间增加扩增产物产量,提高DNA聚合酶的反应效率;通过rpsL保真度实验显示,对照组PCR产物的错误率为5.32×10–6,而实验组的错误率仅为2.39×10–6.     

木芙蓉叶抗菌活性及其有效部位研究

采用乙醇回流法对木芙蓉叶粉末进行活性成分提取,用不同极性溶剂（石油醚、乙酸乙酯和水）对粗提物分别进行萃取。采用连续稀释法评价粗提物及其萃取组分对多种细菌的抗菌活性。结果显示乙酸乙酯和石油醚层萃取组分的抑菌活性良好,对各种菌株的最低抗菌浓度（MIC）在1.25~5 mg/mL之间。其中,石油醚萃取组分对枯草芽孢杆菌CMCC 63501的最小抗菌浓度达到0.625 mg/mL,抗菌效果最佳。乙酸乙酯萃取组分对四种耐药菌株也表现出较好的抗菌活性,其MIC值达到1.25或者2.5 mg/mL。本研究初步确定木芙蓉叶乙醇提取物具备广谱的抗菌活性,其有效部位为石油醚与乙酸乙酯萃取相,这为木芙蓉叶抗菌成分的提取分离及抗菌产品的开发提供了科学的理论及实验依据。