斜纹夜蛾NPVp74基因的克隆及部分序列分析

以含ｐ７４基因的ＡｃＮＰＶＥｃｏＲⅠ－Ｐ片段作探针,与ＳｌＮＰＶ基因组在非严格条件下进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,将ＳｌＮＰＶｐ７４基因定位于４９００ｂｐ的ＳｌＮＰＶＸｈｏⅠ－Ｐ片段．对ＳｌＮＰＶＸｈｏⅠ－Ｐ片段中的一段９４０ｂｐ的ＤＮＡ片段进行序列测定,通过ｉｎｔｅｒｎｅｔ经ＢＬＡＳＴ与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中的ｄａｔａｂａｓｅ比较分析发现,序列中的一段２４３ｎｔ序列与ＡｃＮＰＶｐ７４基因有６０％的同源性,一段８１ｎｔ序列与ＡｃＮＰＶｐ７４基因的同源性高达７９％．与ＣｆＮＰＶｐ７４相比,２段２６４ｎｔ和１００ｎｔ序列分别有６０％和７１％的同源性．测得序列中的部分序列与ＢｍＮＰＶ、ＯｐＮＰＶｐ７４基因也有高达５８％～７８％的同源性．同时,这部分序列编码的氨基酸与ＡｃＮＰＶ及ＯｐＮＰＶＰ７４蛋白的氨基酸序列也有很高的同源性．结果表明所测序列的一部分为ＳｌＮＰＶＰ７４蛋白Ｃ－端的编码序列．     

SlNPV PK基因的部分序列分析

ＳｌＮＰＶ基因组ＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢ－Ｘｂａ片段上含有部分的ＰＫ基因，ＳｌＮＰＶＰＫ的氨基酸序列与ＨａＮＰＶ，ＨｚＮＰＶＳｐｌｉＮＰＶ，ＡｆＮＰＶ，ＡｃＮＩＶ，ＬｄＮＰＶＰＫ氨基酸序列的同源性分别为４５％，４４％，８９％，３７％，３８％和３７％，其上含有蛋白激酶的特征序列ＩＶＨＡＮＤＶＫＬＥＮＶＬ。     

大肠杆菌基因启动子探针型载体的构建

利用ＰＣＲ技术将ｐＵＣ１８和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中的多克隆位点区（ＭＣＳ）及旁侧序列分别进行扩增,然后将扩增产物插入到已除去ＬａｃＺα基因的ｐＵＣ１８中,获得三个中间载体ｐＳＵＧＶ１,ｐＳＧＶ２和ｐＳＵＧＶ３,最后将ｐＳＵＰＶ２中无表达活性的新霉素磷酸转移酶Ⅰ（ＮＰＴⅠ）基因分别插入到三个中间载体的ＭＣＳ中,构建成功大肠肝菌基因启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ４,ｐＳＵＰＶ５和ｐＳＵＰＶ６．     

ANLL中转录因子GATA—2基因点突变

了解转录因子ＧＡＴＡ－２基因在ＡＮＬＬ中的表达和突变情况,方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ检测８５例ＡＮＬＬ病人外周血单个核细胞中ＧＡＴＡ－２基因的表达情况,ＰＣＲ产物进一步经单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析以了解基因突变情况。结果：绝大多数ＡＮＬＬ都表达了ＧＡＴＡ－２基因（８９．４％）,ＳＳＣＰ分析发现一例Ｍ２型的ＰＣＲ产物出现异常迁移带,核苷序列分析显示在ＧＡＴＡ－２基因第８９２位的核苷酸出现点突变,即第     

含多种抗真菌病基因植物表达载体的构建

含有大麦核糖体失活蛋白（ＢＲＩＰ） 编码序列的质粒ｐＲＣ２４／ＢＲＩＰ改造后, 依次与含有水稻碱性几丁质酶基因ＲＣＨ１０ 和水稻酸性几丁质酶基因ＲＡＣ２２ 编码序列的质粒ｐＡＢＣ２ 以及含有苜蓿β１ , ３葡聚糖酶编码序列的质粒ｐＡＡＧ８９ 连接, 得到了中间载体ｐＲＡＳ１０ ．ｐＲＡＳ１０再与根癌农杆菌双元载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ 连接, 得到了适合水稻转化的双元载体ｐＲＡＳ１３００ ． 利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４ 中, 并准备将ｐＲＡＳ１３００ 转入水稻, 以期获得对真菌病有广泛且较强抗性的水稻品种     

SlNPV多角体蛋白基因的序列分析

ＳｌＮＰＶ多角体蛋白基因的开放读码框为７５０ｂｐ,编码２４９个氨基酸的蛋白质,是目前所发现的最长的多角体蛋白基因．ＳｌＮＰＶ多角体蛋白Ｍｒ＝２９２３６,其氨基酸序列与其它核多角体病毒的多角体蛋白氨基酸序列有高度同源性．     

QIAquick Gel Extraction Kit提取和纯化PCR产物用于AML中GATA-2基因突变的分析

转录因子ＧＡＴＡ家族是１９８９年首次发现的锌指结构家族转录因子。其中ＧＡＴＡ２在造血干细胞的增殖和分化中起重要作用［１］。绝大多数急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）细胞表达ＧＡＴＡ－２基因［２］。在分析ＧＡＴＡ－２基因表达中，发现ＧＡＴＡ－２突变的现象［...     

水稻基因组中U2snRNA基因的结构分析

对水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）Ｕ２ｓｎＲＮＡ基因的结构分析结果表明单子植物水稻的Ｕ２ｓｎＲＮＡ基因以多基因家族的形式存在,且Ｕ２ｓｎＲＮＡ基因中存在连锁现象。３个新的水稻Ｕ２ｓｎＲＮＡ基因和已报道的ＦＤＲＧＵ２－３一样,编码区上游除含有植物ＵｓｎＲＮＡ基因共有的ＵＳＥ和ＴＡＴＡ元件外,还含有单子叶植物ＵｓｎＲＮＡ所特有的ＭＳＰ元件,且具有保守的四茎环二级结构,基因成员间的同源性最低为８５．１＾     

枯草杆菌强基因启动子DNA片段的序列分析

对利用基因启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ２,从枯草杆菌ＡＳ１．３９８中克隆３个稳定的具有强启动功能的ＤＮＡ片段,进行限制酶切分析发现,ｐＢＳＵ２２和ｐＢＳＵ４３中的插入片段小于０．２ｋｂ,ｐＢＳＵ４４中的插入片段为３ｋｂ。测定结果表明,３个插入片段中都有较为典型的原核生物基因启动子序列,其中ｐＢＳＵ２２和ｐＢＳＵ４３的插入序列几乎完全相同。２     

急性髓细胞白血病中转录因子GATA—2基因的表达和？…

目的：分析急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）中转录因子ＧＡＴＡ－２基因的表达和突变情况。方法：应用反转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测８５例ＡＭＬ的ＧＡＴＡ－２基因表达情况。２５例正常人的外周血或骨髓作为对照。结果：８５例ＡＭＬ中７６例表达了ＧＡＴＡ－２基因。各ＡＭＬ亚型均见ＡＧＴＡ－２表达。在８５例ＡＭＬ发现２例出现至今未报道的ＧＡＴＡ－２基因的突变。在一例ＡＭＬ－Ｍ２病人发现ＧＡＴＡ－２ｃＤＮＡ     

高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因的遗传变异分析

从GenBank中选取8株国内报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株,应用DNAStar软件对其ORF6、ORF7基因序列进行分析,与VR-2332株、LV株、国内及周边国家分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较,并绘制系统进化树.结果表明,高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的ORF6、ORF7核苷酸与VR-2332株的同源性为95.1%-95.4%、93.8%-94.1%,与欧洲型（LV）的同源性为69.4%-69.6%、67.9%-68.5%;ORF6、ORF7推导氨基酸与VR-2332株的同源性为97.7%、94.4%-95.2%,与欧洲型（LV）的同源性为80.0%-80.6%、65.3%-66.1%.系统进化树表明,8株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株仍属于美洲型.说明猪繁殖与呼吸综合征病毒不断变异的现今,ORF6和ORF7基因依然高度保守.     

II型猪圆环病毒ORF2基因的原核表达与初步应用

II型猪圆环病毒(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原.本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORF2为模板,扩增截短的ORF2(tORF2)基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-tORF2并转化大肠杆菌BL21(DE3).经SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功表达了谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的tORF2,重组蛋白分子量约为45ku,表达量约为菌体总蛋白的20%,重组蛋白具有良好的免疫学活性.用tORF2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)阳性猪血清进行Western blot检测,有4份(20%)血清显示PCV2抗体阳性,说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象.本研究初步证明表达的tORF2重组融合蛋白可以应用于临床检测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCM株ORF5基因抗原表位克隆表达及其免疫性研究

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒SCM株(PRRSV-SCM)囊膜糖蛋白GP5的免疫原性,利用RT-PCR方法从PRRSVSCM株ORF5中扩增大小为231bp的目的基因并构建表达载体PET32-GP5,将其转入大肠埃希菌Rosetta,运用IPTG通过条件优化诱导其表达.检测结果表明:最佳诱导条件为IPTG浓度1mmol/L在37℃下作用5h,表达大小约28kU的融合蛋白.通过Western-blot和间接酶联免疫吸附试验检测表达蛋白,结果显示该原核表达的融合蛋白可与PRRSV阳性血清发生反应,证明该蛋白具有免疫反应性.这为将来研制检测试剂盒以及后续研究PRRSV亚单位疫苗提供了重要依据.     

猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与序列分析

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）已发表的核苷酸序列，设计了1对特异性引物P1／P2，用RT-PCR扩增了PRRSV福建毒株FJ-1和FJ-2的全长核衣壳蛋白基因（ORF7），将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B，提取阳性重组质粒进行序列测定与分析．结果表明：FJ-1和FJ-2毒株ORF7基因均为372bp，编码123个氨基酸，与美洲型参考毒株VR-2332及欧洲型参考毒株LV的核苷酸同源性分别为95．16％，94．35％和61．40％，60．65％，其推导的氨基酸同源性分别为95．93％，95．12％和56．49％，55．73％．研究表明，福建流行的FJ-1和FJ-2属于美洲型PRRSV毒株．     

猪繁殖和呼吸综合征病毒福建毒株ORF5的序列分析及原核表达

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(p1/p2),用RT-PCR扩增PRRSV福建毒株FJ-1的全长糖基化囊膜蛋白基因(ORF5),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一条引物(p3)与p2从重组载体pUCm-T-ORF5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入表达载体pGEX-4T-3后在大肠杆菌中表达.结果表明,FJ-1毒株ORF5基因为603 bp,编码200个氨基酸,与北美型参考毒株VR-2332、CH-1a及欧洲型参考毒株LV的氨基酸同源性分别为87%、89%和53%,推定福建毒株FJ-1属于北美型毒株.原核表达产物经过SDS-PAGE及Western Blot分析,证实为GP5与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白.分子量为41 kDa.表达量约占菌体蛋白的15%,主要以包涵体形式存在.     

预测酵母基因组中基因数目的一种方法

分析了酵母（Sacclznromyces cerevisiae，Scer）、大肠杆菌（Escherichia，Ecoli）和枯草杆菌（Bacillus subfilis，Bsub）基因组中基因和开阅读框架（open reading frame，ORF）的数目随长度的分布，发现不同生物的分布相似且有明显的规律性，并依照此规律估计了酵母基因组中基因数目约为5752个．本文的方法对于评估理论预测基因的可靠性具有建设性意义．     

猪圆环病毒2型ORF2基因及片段的原核表达

目的表达猪圆环病毒2型ORF2抗原,为研制猪圆环病毒2型血清学诊断方法以及生物制品生物安全性检验,提供技术支持。方法根据猪圆环病毒2型(PCV2)LC株序列,设计合成5对引物,采用PCR方法从全序列重组质粒PCV2-LC中扩增出了ORF2基因和4个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到原核表达载体PET-32a上,再分别将各个重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,用终浓度1 mmol/LIPTG诱导。结果表达产物以包涵体的形式存在,经Western-blot检测表明,表达的重组蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。表达的重组蛋白为ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因3′端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV-Ch的RNA为模板，经反转录PCR扩增，将获得的ORF2a的3′端1kb cDNA克隆于pUCl9中，构建成重组质粒pLR7，经PCR检测、酶切检测，表明获得了ORF2a的3′端1kb cDNA克隆．从两端进行了两次序列分析，将获得的核苷酸序列与国外报道的四个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较．结果表明它们具有高度同源性．文中对核苷酸中存在的可能移码序列及其下游的茎环结构(或假节结构)，以及上游特征性三次重复序列进行了分析和讨论，发现上游特征性三次重复序列连续排列可形成几个连续的互补双链区和发夹结构，这一结构可能与移码有关．     

鲤鱼NOD1基因克隆与组织特异性表达分析

利用RT-PCR技术在鲤鱼(Cyprinus carpio)中首次克隆得到了NOD1基因编码序列全长。生物信息学分析发现,鲤鱼NOD1具有3个保守结构域和相应的保守位点,在进化中与草鱼亲缘关系最近;半定量RT-PCR分析NOD1基因在鲤鱼不同组织中分布发现,NOD1在头肾和血液中表达最高,在肌肉、皮肤和性腺中表达量最少;鳗弧菌(V.anguillarum)刺激后NOD1基因在肝脏、脾脏、头肾和前肠中表达量都有明显上升。研究结果显示NOD1在鲤鱼应对鳗弧菌刺激天然免疫过程中可能发挥着重要作用。