驱动蛋白Kif4A杆状病毒表达系统的构建与优化

目的为了探究人驱动蛋白分子Kif4A在有丝分裂过程中的作用及其调节机制,需要在体外表达并纯化有活性的Kif4A蛋白。方法构建了驱动蛋白Kif4A的体外真核表达载体pFastBac-Kif4A,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆,抽提得到杆状病毒基因组。由于杆状病毒基因组较大,标准的转染方法转染效率较低,对该方法进行了优化。将杆状病毒基因组通过标准的和优化的转染方法转染到草地夜蛾卵巢细胞SF9中,经培养得到表达驱动蛋白Kif4A的初代杆状病毒。结果通过检测初代杆状病毒的滴度,我们发现,与标准的转染方法相比,优化的转染方法所得到的初代杆状病毒的滴度更高,相同稀释度感染条件下表达的Kif4A蛋白水平更高。结论本研究成功构建了Kif4A杆状病毒表达系统,并优化了SF9细胞转染的方法,为后续大量表达和纯化Kif4A蛋白奠定了基础。     

驱动蛋白Kif18A多克隆抗体的制备、纯化及免疫特异性检测

采用标签蛋白诱导表达纯化、蛋白质谱、Western Blot、免疫荧光染色等多种分子生物学与细胞生物学方法,探究了一种制备蛋白特异性多克隆抗体、检测抗体并且运用抗体获得蛋白翻译后修饰信息的实验思路.结果表明,使用这种方法可以高效地得到Kif18A的兔源多克隆抗体.得到的抗体血清可以很好地应用于Western Blot(蛋白免疫印迹)、Co-IP(免疫共沉淀)等分子生物学实验.将抗体血清纯化后可以应用于免疫荧光染色实验,并可以获得良好清晰的实验结果.此外,利用制备出的Kif18A特异性抗体对细胞内源性Kif18A进行Co-IP实验后进行质谱分析,得到了内源性Kif18A蛋白翻译后的修饰信息,为研究Kif18A蛋白的定位与功能奠定了良好的基础.     

利用Tn5转座子构建杆状病毒AcMNPV随机突变体的初步研究

以杆状病毒模式种AcMNPV为研究对象,应用基于Tn5转座子的随机转座的方法,构建杆状病毒突变体库将果蝇hsp70启动子后接绿色荧光蛋白基因后插入Tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体．利用体外转座系统将转座子随机插入AcMNPV基因组,并用转座反应液转染Sf21细胞,得到了表达绿色荧光蛋白的病毒突变体库进一步纯化了两株病毒B9F和Li6A,进行了转座子插入位点的分析,确定两株病毒中,转座子分别插入了94K基因和p10基因．该方法将为杆状病毒功能基因组研究提供重要的手段。     

昆虫细胞中共表达人糖基转移酶对重组蛋白SEAP表达的影响

杆状病毒-昆虫细胞表达系统有表达量高及蛋白翻译后修饰较完善等特点,但与哺乳动物相比其缺乏几种关键的糖基转移酶.许多研究表明将哺乳动物的糖基转移酶基因转入昆虫细胞中,能使得昆虫细胞表达蛋白的修饰得到有效改善.本研究通过RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺转移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseⅡ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因,并将它们分别插入重组杆状病毒上,获得了表达GnT2和β4GalT1的重组杆状病毒.以具有糖基化修饰位点的人分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase,SEAP)为对象,将表达糖基转移酶的重组杆状病毒和表达SEAP的重组杆状病毒共感染细胞,Western blot分析结果表明共感染时所表达的SEAP蛋白条带分子量明显大于其单独表达时的分子量.结果表明重组病毒共感染对杆状病毒-昆虫细胞表达的SEAP有修饰作用.     

驱动蛋白Kif22多克隆抗体的制备、纯化及免疫特异性检测

为深入研究驱动蛋白分子Kif22在细胞内的功能,应用分子克隆技术构建原核细胞表达质粒p HIS8-Kif22C156和p GEXKG-Kif22C156,并在细菌BL-21中诱导表达HIS8-Kif22C156和GST-Kif22C156.用Ni-NTA琼脂糖结合HIS8-Kif22C156蛋白进行蛋白纯化,然后免疫新西兰大白兔制备特异性多克隆抗Kif22抗体;用谷胱甘肽琼脂糖结合GSTKif22C156蛋白进行交联,纯化多克隆兔抗Kif22抗体.蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光染色实验证明纯化的抗体可以特异性识别细胞中的Kif22蛋白,表明Kif22多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度.     

利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPVl6E6蛋白

目的 利用昆虫一杆状病毒表达系统高效表达HPVl6E6蛋白.方法 将HPVl6E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTB),然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的 基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,westem-b10t分析鉴定表达蛋白.结果 SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白.结论 利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达.     

人尿激酶原纤原受体识别区嵌合突变体的构建与表达

采用同源转座方法,构建了在尿激酶原K区138～139位点插入了赖氨酸甘氨酸天冬氨酸(KGD)序列的2种尿激酶原嵌合体基因(proUK-KGDW, proUK-KGDS),并以昆虫细胞SF9为宿主获得了高效表达,表达量在33.34 μkat·mL-1, 细胞密度为106·mL-1,表达高峰期表达产物占细胞总蛋白的15%以上.表达产物展示出较高的纤溶活性,并具有良好的人尿激酶原免疫原性,同时,经SDS-PAGE试验检测,昆虫细胞分泌的突变体相对分子质量符合理论预期,为5.4×104,绝大多数为单链态形式.经过离子交换、分子筛层析及超滤浓缩等步骤对突变体蛋白进行了初步纯化,光浊度法试验表明含有KGDW序列的尿激酶原突变体具有较强的血小板聚集抑制活性,而含有KGDS序列的突变体几乎不具有任何活性,表明羧基端边侧序列对KGD展示正常的受体结合活性影响较大.溶解圈试验表明2种突变体均保留了较高的纤溶活性,说明插入序列不影响尿激酶原的酶切活性.     

人类隐花色素蛋白(Homosapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与FAD结合状态的NMR研究

隐花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白是一种对蓝光敏感的蛋白,它与辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)形成的自由基电子对在调节生物钟及感应磁场中发挥重要的作用,但目前对人类CRY(Homo sapiens CRY,HsCRY)蛋白的结构功能研究尚未见报道.以HeLa细胞RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到全长1 761bp的HsCRY1基因,把其克隆到HTA杆状病毒转座载体上,经菌落PCR和测序鉴定出阳性重组转座载体HTA-HsCRY1,转化含有病毒杆粒bacmid的DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选和PCR检测获得重组质粒BacmidHsCRY1,转染昆虫Spodoptera frugiperda(sf9)细胞,产生的病毒感染昆虫细胞获得分子量为66kDa的目的蛋白HsCRY1.蛋白经Western Blot和SDS-PAGE鉴定,并利用镍亲和层析柱纯化,结果100mmol/L及200mmol/L咪唑均可洗脱下较纯的目标蛋白.同源蛋白的多序列比对表明HsCRY1的W320,W374以及W397可能组成传递电子的色氨酸三联体,对3个突变蛋白W320F,W374F以及W397F进行表达纯化.31P核磁共振检测蛋白与辅因子FAD的结合状态,发现与自由态FAD的磷谱相比,野生型HsCRY1及突变体3(W397F)结合的FAD的化学位移发生了改变,而HsCRY1突变体1(W320F)以及突变体2(W374F)不结合FAD.本实验成功构建了表达HsCRY1蛋白及其色氨酸突变蛋白的杆状病毒-昆虫表达系统,并通过核磁共振的方法发现色氨酸突变位点会对蛋白与FAD的结合产生影响.     

小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析

目的 利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白，并对其免疫原性分析。方法 将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒，提取重组杆粒经PCR鉴定正确后转染昆虫细胞Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒rBac-MVM VP2。Sf9细胞接重组病毒48和72 h后，用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果 构建的rBac-MVM VP2重组杆状病毒感染Sf9细胞后，可成功表达MVM VP2重组蛋白，经Western blot和IFA检测分析，重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染72 h时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的VP2重组蛋白。结论 本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性，为VP2相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。     

利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPV16E6蛋白

目的利用昆虫-杆状病毒表达系统高效表达HPV16E6蛋白。方法将HPV16E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTb,然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的基因的杆状病毒转染昆虫（Sf-9）细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,Western-blot分析鉴定表达蛋白。结果SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,Western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白。结论利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达。     

驱动蛋白分子Kif14细胞内中小体定位的研究

为了探讨决定人体驱动蛋白分子Kif14在细胞有丝分裂末期时定位于细胞中小体的功能域,构建了驱动蛋白分子Kif14各功能域的绿色荧光蛋白(GFP)真核细胞表达质粒,分别转染于人体子宫颈癌细胞He La中.应用聚丙烯酰氨凝胶电泳和免疫印迹法(Western Blot)检测各蛋白的表达情况;应用免疫荧光染色法(immunofluorescence)分别对微管蛋白(Tubulin)、着丝粒相关蛋白(CREST)和DNA染色,荧光显微镜下观察各绿色荧光融合蛋白在有丝分裂末期的亚细胞定位.结果发现,细胞有丝分裂末期,驱动蛋白分子Kif14的N末端GFP融合蛋白定位于中小体(midbody),马达区GFP融合蛋白沿微管分布,杆状尾区GFP融合蛋白以点状分布于细胞质,尾区GFP融合蛋白分布于整个细胞中.由此认为,Kif14驱动蛋白分子的N末端延伸区决定该蛋白分子在细胞有丝分裂末期定位于中小体.     

重组人神经生长因子昆虫表达载体的构建及表达

目的:构建重组人神经生长因子(rh-NGF)杆状病毒表达载体,转染昆虫细胞从而获得目的蛋白的大量表达.方法:从人胎盘组织中提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增-NGF基因片段,经BamHI、HindⅢ双酶切后插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTM-Dual+[rh-NGF].对构建的载体进行PCR和酶切鉴定并测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA对rh-NGF的表达进行检测.结果:构建的rh-NGF基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA检测结果显示病毒感染的Sf9细胞可表达rh-NGF.结论:成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[rh-NGF],并在昆虫细胞系Sf9中得到表达,为大量制备重组人神经生长因子奠定了基础.     

八肋游仆虫核糖体蛋白P1A磷酸化位点分析

为了探讨单细胞真核生物八肋游仆虫酸性核糖体蛋白P1(EoP1)的磷酸化作用,对EoP1的一个亚型EoP1A进行了磷酸化位点分析。通过在线软件预测EoP1A的磷酸化位点,根据预测结果进行定点突变,随后对EoP1A野生型及突变体分别在大肠杆菌中进行了表达纯化。利用核磁共振(NMR)检测EoP1A的体外磷酸化作用,结果表明位于蛋白N端的第8位丝氨酸(Ser8)为CK2磷酸化EoP1A蛋白的磷酸化位点。     

CUEDC2突变体的构建及在原核和昆虫表达系统中的表达

目的：构建CUEDC2的突变体并在原核和昆虫表达系统中表达验证。方法：根据人cuedc2序列设计引物,以其突变体质粒为模板PCR扩增目的片段,酶切后连接至pET28a原核表达载体以及pFastBac1-Flag-N和pFastBac-HTA昆虫表达系统的表达载体,转化至DH5α后提取质粒,经菌液PCR、测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)及DH10Bac感受态细胞中。原核表达载体在E.coli中表达后用Ni-NTA亲和纯化,SDS-PAGE检测。昆虫表达载体提取杆粒,转染至昆虫细胞Sf9中表达,最后用western 进行鉴定。结果：成功构建了CUEDC2的突变体,并在原核和昆虫表达系统中表达。结论：在原核和昆虫表达系统中,成功表达的CUEDC2突变体蛋白为CUEDC2的结构和功能研究奠定了基础。     

具有磷酸酶活性的重组PTEN蛋白可抑制癌细胞的迁移

PTEN是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌因子,可通过对粘着斑激酶的去磷酸化抑制细胞迁移.在前期研究工作中证实了在大肠杆菌中表达的重组PTEN 蛋白具有抑癌活性后,本研究进一步检测重组PTEN 蛋白的磷酸酶活性及其对粘着斑激酶FAK 磷酸化程度和细胞迁移的影响.对[D3-32P]PIP3体外去磷酸化的实验表明重组PTEN蛋白具有明显的脂质磷酸酶活性;将重组PTEN蛋白转染DU-145细胞后,细胞中FAK的磷酸化水平明显下降,表明重组PTEN蛋白具有蛋白磷酸酶活性.细胞迁移实验结果表明转染的重组PTEN蛋白可以抑制DU-145细胞的迁移作用,从而起到抑制肿瘤转移或浸润的作用.     

昆虫杆状病毒可调控表达系统的初步研究

构建了2株用不同启动子表达tet阻遏蛋白Tet-off,并同时带有tet响应元件及报道基因表达框的重组杆状病毒,研究了其受诱导物(强力霉素)调控表达报道基因的情况.W estern b lot和流式细胞仪分析表明,这两株病毒感染昆虫Sf9细胞后,在有诱导物存在时报道基因egfp表达水平明显高于无诱导物时的表达水平,表明Tet-off可调控表达系统可以用于在昆虫Sf9细胞调控相关基因的表达,这项研究为构建更加有效的可调控杆状病毒表达系统提供了基础.     

线粒体lncRNA IDL影响非小细胞肺癌氧化磷酸化

为了探究线粒体长链非编码RNA(mitochondrial long non-coding RNA,mtlncRNA)IDL在人非小细胞肺癌细胞(human non-small cell lung cancer, NSCLC)代谢和生长中的作用及机制，本研究首先在A549细胞中通过线粒体压力测试发现敲低IDL会导致细胞的氧化磷酸化功能受损，接着通过细胞增殖实验、划痕实验和克隆形成实验，证明了敲低IDL时人非小细胞肺癌细胞A549和H1299的生长速度变慢、迁移能力和克隆形成能力减弱.随后通过RNA沉降实验(RNA pull-down)和RNA免疫沉淀实验(RIP)找到了在体内外均可以与IDL特异性结合的蛋白——ATP合成酶α亚基，即ATP5A1蛋白，并通过免疫共沉淀实验(Co-IP)证明了IDL下调会导致ATP5A1蛋白的O-GlcNAc修饰水平增加，在A549细胞中敲低ATP5A1也得到了与敲低IDL时一致的细胞表型.以上结果说明敲低IDL会导致非小细胞肺癌细胞氧化磷酸化功能受损、细胞生长受抑制.     

重组酵母Saccharom yces cerevisiae蛋白激酶Sch9的分泌表达与活性鉴定

为了深入研究蛋白激酶Sch9的生物化学特性,在Pichia pastoris酵母KM71H菌种中分泌表达并纯化了重组Sch9蛋白.进一步通过体外磷酸化实验分析了重组Sch9蛋白的蛋白激酶活性.通过重组蛋白质工程的手段初步研究了Sch9蛋白的生物化学和酶学特性.     

Star-PAP蛋白的纯化分析及其限定性因子的分离

克隆并构建了Star-PAP的表达载体,然后将该载体转染HEK293细胞,经纯化得到了重组的Star-PAP蛋白.以细胞总RNA和体外转录的U6snRNA为底物,对纯化到的Star-PAP的TUTase活性进行了分析.结果显示重组的Star-PAP能够对细胞总RNA以及U6snRNA进行体外尿苷化修饰,表明纯化到的Star-PAP具有良好的TUTase活性.此外,使用HPLC分离得到了具有U6snRNA底物特异性的细胞核组分.该组分除了含有StarPAP外,还含有一种未知蛋白,该未知蛋白可能就是赋予Star-PAP底物特异性的限定性因子.     

MST1的酵母双杂交及与Salvador体外结合的研究

利用酵母双杂交系统,以鼠M ST 1(M amm alian STE 20-1 ike 1)为诱饵蛋白,在鼠胚胎库中筛选到22个Salvador的片段。通过E.coli表达系统纯化了6个组氨酸(6H is)融合的M ST 1和谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合的Salvador,并做体外蛋白质结合实验,进一步证实了两蛋白质相互结合。通过体外激酶活性分析,发现M ST 1并不直接磷酸化Salvador,但是Salvador能够较强地抑制M ST 1对M BP(磷酸丁酯)的磷酸化,提示有可能Salvador通过影响M ST 1的激酶活性来参与了M ST 1介导的细胞凋亡途径。