双功能促胰岛素水蛭素(5rolGLP-HV)的构建及功能分析

采用分子克隆方法获得5拷贝口服长效促胰岛素多肽（rolGLP-1）和水蛭素（rHV）融合基因促胰岛素水蛭素（5rolGLP-HV）, 并将该基因克隆至pET22b(+)表达载体上, 转化大肠杆菌BL21（DE3）, 实现了高效表达. 表达产物经SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定后用Ni-NTA]亲和层析柱纯化, 得到高纯度的5rolGLP-HV. 用STZ诱导Ⅱ型糖尿病小鼠和血栓模型鼠进行药物功能分析, 结果表明, 5rolGLP-HV有较好的降糖和抗血栓效果.     

含RGD序列水蛭素嵌合抗栓剂的构建与表达

通过对水蛭素及一些含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的多肽类血小板聚集抑制剂结构与功能的分析,设计并构建了两个在水蛭素C端融合RGD序列的嵌合分子。嵌合体基因分别重组到表达载体pET-21a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经限制酶消化和DNA序列分析,证明两种重组质粒与设计完全一致。由于RGD-水蛭素嵌合基因上游连接了金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的信号肽序列,在IPTG诱导下两种嵌合分子都获得了分泌表达,表达产物主要集中在细胞周质空间。通过离子交换层析和凝胶过滤层分别对两种嵌合体蛋白进行纯化,纯化产物在Tricine-SDS-PAGE中都显示为单一条带。活性分析结果表明两种嵌合体蛋白在保留水蛭素抗凝血酶活力的同时,还呈现抗血小板聚集活性。     

水蛭素基因植物表达载体的构建

在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下,根椐植物基因密码子选择偏向,对水蛭素基因序列进行了改造．在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、poly(A)尾、XbaⅠ和SacⅠ双酶切位点．将所合成序列与双元载体pBI121重组,构建成pBI121-hir植物高效表达载体．经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3种方法鉴定,该载体构建成功．     

家蚕促咽侧体素受体基因克隆及发育表达

文章克隆得到家蚕(Bombyx mori)神经肽促咽侧体素受体基因(Allatotropin receptor,BommoATR),开放阅读框全长为1 254 bp,编码416个氨基酸.Bommo-ATR氨基酸序列的二级结构预测为7次穿膜蛋白,符合GPCR家族成员的典型特征.实时荧光定量PCR结果表明,家蚕脑-咽下神经节复合体中的ATR mRNA在5龄幼虫期表达量最高,其次为蛹后期,蛹前期和成虫阶段表达量最低.其中5龄幼虫第2天表达量最高,1～5 d持续维持较高的表达水平,这可能与保幼激素的合成有关.     

rhIGF-I对大鼠骨质疏松性骨折愈合过程中OPG表达的影响

目的:观察骨质疏松性骨折愈合不同阶段骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的表达,探讨胰岛素生长因子-I(recombinant human insulin-like growth factor,rhIGF-1)对该过程OPG表达的影响.方法:6月龄雌性大鼠40只,制备右股骨骨质疏松性骨折模型后,随机分为IGF治疗组及生理盐水对照组,并分别于术后第10、20、30、40 d取骨痂,通过RT-PCR及ELISA检测各组骨痂OPG表达.结果:在大鼠骨质疏松性骨折愈合过程中成骨细胞活性降低,OPG表达呈弱阳性表达,骨折愈合缓慢;rhIGF-1局部注射治疗能增加骨痂中OPG的表达量(P＜0.05),促进骨质疏松性骨折愈合.结论:OPG是rhIGF-促骨质疏松性骨折愈合的重要下调因子.     

胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞中脂联素mRNA表达的研究

目的:通过本实验研究脂联素mRNA在胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞中的表达.方法:培养3T3-L1前脂肪细胞,诱导分化为脂肪细胞,采用地塞米松诱导建立3T3-LI脂肪细胞胰岛素抵抗模型,运用RT-PCR技术检测脂联素mRNA的表达.结果:随着胰岛素抵抗的发生,脂联素mRNA的表达量明显降低,经过罗格列酮干预胰岛素抵抗后,干预组脂联素mRNA表达量较空白组升高了约103.5%.结论:脂联素mRNA表达量与胰岛素抵抗的发生关系密切,其有望作为治疗胰岛素抵抗的靶基因.     

水蛭素基因的递归PCR合成和在大肠杆菌中的表达与分泌

水蛭素是凝血酶最强的特异抑制剂，可望成为预防和治疗各种血栓疾病的有效药物。根据医用水蛭头部水蛭素（ＨＶ－２）的氨基酸序列，通过递归ＰＣＲ，合成水蛭素基因，并重组到本实验室改建的大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－＝ｏｍｐＡ－ＨＩ中，使水蛭素基因的编码序列直接位于大肠杆菌外膜蛋白Ａ信号肽序列的下游。转化大肠杆菌ＤＨ５α，筛选出重组体，经ＰＣＲ，限制酶切图谱和序列分析，结果表明所合成的水蛭素基因与设计完全一     

胡椒碱对脂多糖和金黄色葡萄球菌抑制人结肠腺癌细胞系表达防御素的拮抗作用

目的:研究胡椒碱(piperine,PIP)对脂多糖(LPS)和灭活金黄色葡萄球菌(SAC)菌体抑制人结肠腺癌HT-29和Caco-2细胞表达防御素(Defensin)的影响.方法:WST-1法检测PIP对HT-29和Caco-2细胞增殖的作用;定量PCR(qRT-PCR)检测人α防御素DEFA5(HD5)和DEFA6(HD6),人β防御素HBD-1以及胰岛再生源蛋白(Reg)Reg IIIγ等mRNA的表达水平.结果:PIP处理可剂量依赖性地抑制HT-29和Caco-2细胞的增殖,半数抑制浓度IC50分别为328.5μmol/L和155.1μmol/L,表明PIP对细胞的毒性较小;定量PCR检测显示,PIP处理对LPS或SAC下调HT-29和Caco-2细胞DEFA5和DEFA6 mRNA表达水平具有显著的拮抗作用,对DEFB1和Reg IIIγmRNA的表达没有明显影响.结论:胡椒碱可能通过拮抗病原体诱导细胞表达防御素的抑制作用,进而发挥其抗肠炎作用.     

水蛭素-RGD序列融合蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达

水蛭素是从医用水蛭唾液腺中分离纯化的一种多肽,分子量约为7 kD.它是天然存在的最专一有效的凝血酶抑制剂,无明显毒副作用,用量低,因此可作为抗栓药物用于治疗血栓性疾病[1～2].RGD序列是纤维蛋白原等粘附因子上以Arg-Gly-Asp为核心的小肽序列[3],通过与活化血小板上纤维蛋白原受体GPⅡb/Ⅲa结合而导致血小板聚集.因此外源RGD序列可通过竞争性结合该受体而阻断血小板的聚集,抑制血栓的形成[4].RGD序列与水蛭素融合可获得同时具有抗凝血酶和抗血小板聚集双功能的新型抗栓剂.本文首次报道重组水蛭素HV3与RGD序列融合蛋白基因克隆并在枯草芽孢杆菌中表达的结果.     

天然水蛭素的提取和纯化(简报)

水蛭素(hirudin)是存在于水蛭唾液中的一种酸性多肽类物质,是迄今为止世界上最强的凝血酶抑制剂,在治疗各种血栓性疾病及弥散性血管内凝血中均有很好的预防及治疗效果,并且没有副作用,因而它比肝素更有优越性。研究表明,水蛭素还能防止肿瘤细胞的转移,用水蛭素配合化疗和放疗,可促进肿瘤中的血流而增强疗效,因而具有宽阔的临床应用前景。     

安舒克栓酶和水蛭素融合基因在枯草杆菌中的表达(简报)

安舒克栓酶(Antithromboase,AT)是本实验室从枯草杆菌N18中分离得到的具有强烈水解纤维蛋白活性的蛋白酶.研究表明,该酶具有直接纤溶和纤溶酶原激活剂的双重作用,且有较强的纤维蛋白亲和性,是极具开发价值的溶栓药物.来源于医用水蛭的水蛭素(hirudin,Hir)是凝血酶的最强有力的天然抑制剂,是极具优势的抗凝药物.但仍各有不足:安舒克栓酶只有溶栓功能,不能抗栓,不能解决血栓治疗中再栓塞的问题;水蛭素只有抗凝作用,不具溶栓功能.如果将这两种从不同途径治疗血栓的药物.通过融合     

Pdx1与Ngn3协同诱导LO2细胞分化为胰腺β样细胞

目的:胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pdx1)与神经源素3(Ngn3)联合诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化.方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1与Ngn3基因.应用分子生物学技术,分别克隆到真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建pEGFP-C1/Pdx1与pEGFP-C1/Ngn3真核表达质粒,并共转染LO2细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法检测目的基因及胰岛素相关基因葡萄糖转运体2(GLUT2)与胰岛素的表达情况.结果:目的基因克隆正确,RT-PCR、免疫组化、间接荧光证实转染后LO2细胞中有Pdx1、Ngn3和胰岛素及胰岛素相关基因GLUT2的表达.结论:Pdx1与Ngn3协同作用可诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化.     

白芥子对蛇床子体外经皮渗透的影响

探讨白芥子促透皮吸收的物质基础.以蛇床子为研究对象,采用改良Franz扩散池,以离体Wistar大鼠背部皮肤为透皮模型,考察白芥子中白芥子碱、白芥子苷和黄酮、白芥子多糖、白芥子脂肪油、白芥子挥发油及不同促渗剂对蛇床子中蛇床子素体外经皮渗透的影响.结果表明,白芥子中挥发油和不同促渗剂均能促进蛇床子素经皮吸收,其作用强弱依次为5%薄荷油(17.842 9μg·cm-2·h-1)5%冰片(17.004 2μg·cm-2·h-1)5%氮酮(16.656 0μg·cm-2·h-1)0.5%白芥子挥发油(16.610 1μg·cm-2·h-1).白芥子中挥发油对蛇床子中蛇床子素具有促透皮吸收作用,百分含量以0.5%为最佳.     

禽类肠道主要APUD细胞分布及其生理功能的研究进展

禽类动物肠道中存在许多能够分泌肽类激素的内分泌细胞(Amine Precursor Uptake and Decarboxylation Cells,APUD细胞),主要包括S细胞、G细胞、D细胞、PP细胞、I细胞、L细胞、N细胞、M细胞、K细胞,它们分别释放肠促胰液素、胃泌素和脑啡肽、生长抑素和血管活性肠肽、禽胰多肽、缩胆囊素、肠高血糖素、神经降压素、胃动素、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽等相关激素,在禽类动物肠道的营养、消化吸收和免疫功能等方面发挥着重要的作用.对禽类肠道主要APUD细胞的种类、分布及生理功能的研究概况进行综述,为深入研究禽类肠道的生理功能提供参考.     

腹腔神经丛阻滞对GK大鼠胰岛素受体底物的影响

观察NCPB对GK(Goto-Kakizaki,GK)大鼠血糖及胰岛素受体底物的影响.构建25只非胰岛素依赖糖尿病(NIDDM)的雄性GK大鼠,随机抽取5只GK大鼠,以NCPB前表示,先进行口服葡萄糖耐受试验(OGTT),然后处死采取肝组织.其余20只GK大鼠随机分为对照组和NCPB组,每组10只.NCPB组给予双侧质量分数0.5%利多卡因进行NCPB,1 mL/侧,每天1次,而对照组以质量分数0.9%生理盐水替换.分别在14 d和28 d后取对照组和NCPB组各5只GK大鼠进行OGTT实验,通过Western Blot检测对照组和NCPB组肝组织中的胰岛素受体底物-1(IRS-1)、IRS-2表达以及IRS-1磷酸化情况.结果表明:NCPB组在14 d和28 d NCPB处理后,在0、60和120 min时的血糖均显著低于NCPB前(P0.05或P0.01)和对照组(P0.01),而血清胰岛素水平与NCPB前和对照组相差不显著;在14、28 d NCPB后NCPB组肝组织IRS-1和IRS-2蛋白表达水平与NCPB前相比均显著增加(P0.01),在相应时间点并显著高于对照组(P0.01);而对照组的肝组织IRS-1丝氨酸307残基的磷酸化水平在14、28 d NCPB后与NCPB前均有所上调(P0.05),NCPB组在相应时间点丝氨酸307残基的磷酸化程度均较NCPB前显著下降(P0.01),且均显著低于对照组(P0.01).NCPB可降低GK大鼠的空腹血糖,减轻GK大鼠糖耐量受损的程度,其机制可能与NCPB提高胰岛素受体底物的蛋白表达和抑制其丝氨酸磷酸化有关.     

两种新型抗血栓药物--水蛭素与水蛭肽

水蛭素是迄今发现的最强的天然凝血酶抑制剂 ,水蛭肽是模仿水蛭素与凝血酶的相互作用机制而合成的肽类化合物。本文介绍了他们的作用机理及其临床研究 ,叙述了他们与肝素相比的优越之外 ,认为水蛭素与水蛭肽是两类非常有前途的抗栓新药。     

水蛭养殖池塘生物组成与生长条件的研究

对人工养殖宽体金线蛭池塘的池水、浮游和底栖生物进行采样,分析池塘的水质、生物组成和数量,探究幼蛭培育、苗种投放和饲养的最优方法,并提出池塘的构建条件和养殖管理措施.结果表明:(1)水蛭养殖池塘的pH、含盐量和碱度均需符合水产养殖水质的标准;(2)在数量上,池塘中的浮游植物以蓝藻为主,浮游动物以原生动物为主,底栖动物以腹足类为主;(3)幼龄水蛭快速生长期为5~15 d;(4)2龄水蛭在收获期的体长达到投放初期体长的3倍,体重达到4倍以上;(5)设置泥土平台、水面种植水葫芦等措施可以促进水蛭生长.     

不同运动强度对青春期肥胖大鼠脂联素的影响

目的:探讨不同运动强度对青春期肥胖大鼠内脏脂肪组织脂联素mRNA表达、蛋白表达及血浆浓度的影响.方法:选取青春期SD大鼠普食8只为单纯空白对照组(C),高脂诱导青春期肥胖32只随机分为4组,每组8只,分为静止对照组(OC)、低运动强度组(OL)、中运动强度组(OM)和高运动强度组(OH).运动速度为15-18m/min、21-25m/min和28-32m/min,坡度均为0,1h/天,5次/周,在大鼠专用运动跑台持续8周的运动干预.8周后用qRT-PCR测内脏脂肪组织脂联素mRNA表达,免疫组化测内脏脂肪组织脂联素蛋白表达,ELISA测血浆脂联素浓度.结果:8周后OL、OM、OH组体重、内脏脂肪重量及体脂率均显著低于OC组(P<0.01),OM、OH组内脏脂肪重量及体脂率显著低于OL组(P<0.01);OM、OH组内脏脂肪脂联素mRNA高于OC、OL组(P<0.05,P<0.01);OH组脂联素蛋白质的表达均比OC组增加;OL、OM、OH组血浆脂联素浓度较OC组显著提高(P<0.01),OM、OH组显著高于OL组(P<0.05,P<0.01).结论:通过8周不同运动强度干预均显著降低了青春期肥胖大鼠体重、内脏脂肪量和体脂率,上调了内脏脂肪组织脂联素mRNA的基因表达及蛋白表达,升高血浆脂联素浓度,均为中、高运动强度效果较明显.     

二仙益坤汤对围绝经期抑郁模型大鼠生殖激素及5-HT受体mRNA表达的影响

目的:观察二仙益坤汤对围绝经期抑郁模型大鼠部分生殖激素水平、神经递质及相关受体的影响,探讨其抗抑郁作用机制。方法:采用孤养结合慢性轻度不可预见性应激复合造模法制作围绝经期抑郁大鼠模型,选取符合条件的雌性围绝经期SD大鼠70只,随机分为正常围绝经期对照组、模型组、补佳乐组、百忧解组、中药二仙益坤汤低、中、高剂量组,连续给药21天后,称量子宫、卵巢湿重,并计算脏器指数,酶联免疫法检测各组大鼠血清中生殖激素促卵泡素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)及海马、下丘脑中神经递质五羟色胺(5-HT)含量,RT-PCR法检测下丘脑5-HTR1A、5-HTR2A受体亚型mRNA表达。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠子宫、卵巢指数降低,血清E2水平降低,FSH、LH水平升高,海马、下丘脑中5-HT含量均降低,下丘脑的5-HTR1AmRNA表达降低,5-HTR2AmRNA表达增高(P<0.05);二仙益坤汤各剂量组与模型组比较,子宫、卵巢指数及E2含量升高,FSH水平降低,海马、下丘脑中5-HT含量升高,5-HTRIA受体mRNA表达上调,5-HTR2A受体mRNA表达下调(P<0.05),结论:二仙益坤汤能通过调节部分生殖激素水平和神经递质及其相关受体亚型的表达从而产生抗抑郁作用。     

体外诱导脂肪组织巨噬细胞极化的模型

肥胖进程中,脂肪组织中的巨噬细胞由抗炎性的M2(2型巨噬细胞)逐渐极化成促炎性的M1(1型巨噬细胞),M1分泌的促炎性细胞直接可以导致胰岛素抵抗等肥胖相关代谢综合症。由于体外常用细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的促炎性巨噬细胞来研究脂肪组织中巨噬细胞的极化,但其与脂肪组织中M1的表型相差甚远;另外,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)可以诱导骨髓细胞分化为骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM)。文章发现GM-CSF诱导的巨噬细胞(GM-CSF-induced macrophages,GM-BMM)高表达脂肪组织M1型标志基因CD11c与NOS2和促炎性细胞因子IL6与TNFα;与此相反,M-CSF诱导的骨髓细胞分化的巨噬细胞(M-CSF-induced macrophages,MBMM)高表达脂肪组织M2标志基因CD206和抗炎性细胞因子IL10。因此,GM-BMM和M-BMM更适合用于脂肪组织巨噬细胞极化的体外研究。