绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5''端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物，以绵羊基因组DNA为模板，PCR扩增出1042bp的特异性片段，连接到pMD19T载体中获得该片段克隆．经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段．DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5＇端调控区序列相比具有很高的一致性．研究结果为今后制备转基因克隆动物，在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础．     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

水稻硝酸还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

以日本晴水稻幼苗叶的基因组总DNA为模板,采用PCR方法扩增获得约1 300 bp大小的DNA片段,回收该片段并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌感受态,并提取质粒DNA.用凝胶电泳检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含1 376个核苷酸对;应用NCBI网站的BLAST软件对本试验中克隆的序列与GenBank(NC_008401)公布的水稻硝酸还原酶基因启动子序列进行比对,有3个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻硝酸诱导基因启动子.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、CAAT-box和GAGA-box).此序列的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

水稻花粉特异性启动子的克隆与表达

利用PCR技术,从水稻幼苗总DNA中扩增并克隆了一段DNA片段。将该片段与报告基因GUS基因融合,构成植物表达载体。经农杆菌转化烟草萌发花粉,共培养约24h后,作瞬时表达检测。结果表明,该克隆片段具有启动子功能。DNA序列分析表明,该克隆片段长度为526bp,含有TATA盒及CAAT盒。与原基因（PSI）启动子序列比较,同源性为52％。部分顺式调控元件相同。     

新疆绵羊β-乳球蛋白(BLG)5′端调控区的克隆与序列测定

用聚合酶链式反应(PCR)技术,从新疆绵羊全血中扩增了β-乳球蛋白5′端调控区890bp的片段.通过T4 DNA连接酶将其连接于质粒载体pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-BLG中含有β-乳球蛋白5′端调控区基因片段.经核苷酸序列测定,克隆的片段与发表的基因序列高度一致.     

山楂Actin基因片段克隆及序列分析

依据GenBank中已知的蔷薇科梨属Actin基因的保守序列设计1对特异性引物,以山楂叶片总DNA和总RNA为模板,分别利用PCR和RT-PCR技术从山楂中克隆得到Actin基因的DNA片段和cDNA片段,测序得到山楂Actin基因DNA片段长度为1 578 bp,cDNA片段长度为1 005 bp,编码334个氨基酸。生物信息学软件分析表明,该核苷酸序列与苹果、梨、桃的Actin基因同源性较高,分别为98%,97%,95%,而编码的氨基酸序列与苹果、梨、桃则完全相同,属间具有很好的保守性。试验克隆得到的基因为山楂Actin基因,命名为CpActin。进化树分析结果进一步表明,该Actin序列与苹果、梨、桃和草莓等亲缘关系最近;半定量RT-PCR结果显示,CpActin在山楂的叶片、花柱和花粉中能够稳定表达,可作为山楂的内参基因。     

盐生盐藻肌动蛋白基因及其5′上游片段的克隆

在盐生盐藻 c DNA文库和基因组文库中对肌动蛋白基因进行了筛选 ,结果得到了一个c DNA克隆和两个基因克隆 ,并进一步从基因克隆中克隆出该基因的 5′上游片段 .检索结果表明 ,所得到的 c DNA和基因属于盐生盐藻的肌动蛋白基因 .通过将盐生盐藻肌动蛋白基因序列同其c DNA序列及其他生物的肌动蛋白序列相比较 ,给出了一个此基因 5′上游区大概的结构     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

大豆11S球蛋白基因Gy1启动子克隆及序列分析

以高蛋白大豆品种南农87C-38总DNA为模板,采用PCR法扩增获得约1100bp大小的DNA片段,回收该片段并克隆到puCm-T载体上,选取阳性克隆进行PCR和酶切检测,再进行测序分析.序列分析显示该片段含1174个核苷酸,采用Vector NTI软件将试验中克隆的序列与GenBank E07850报道的Gy1启动子和GenBank X15121报道的Gy1启动子及信号肽对应序列分别进行比对,同源性分别为99.6%和99.3%.确定该片断为南农87C-38大豆11S球蛋白基因Gy1启动子及信号肽.该启动子的成功克隆,可为今后利用基因工程技术改良大豆种子营养品质研究奠定基础.     

藏绵羊KAP3.2基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达的研究

为研究藏绵羊角蛋白相关蛋白(KAP3.2)基因结构与功能,揭示该基因的组织特异性表达规律.以藏绵羊为研究对象,分别提取藏绵羊心、肝、脾、肾及皮肤组织中总RNA,并以此为模板,通过RT-PCR技术对藏绵羊KAP3.2基因的c DNA进行克隆、序列分析;利用Real-time PCR技术进行组织表达研究.结果表明:藏绵羊KAP3.2基因编码区全长297bp,编码98个氨基酸;藏绵羊与普通绵羊、山羊、藏羚羊、草原鼠、家鼠、人的相应核苷酸同源性分别为99%、97%、96%、79%、75%、73%;藏绵羊KAP3.2基因在皮肤中高表达,而在其它组织中相对表达量较低,说明该基因的表达具有组织特异性.     

甜瓜果实特异性表达黄瓜素基因启动子区的克隆和序列分析

黄瓜素(cucum is in)是甜瓜类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶,其表达具有果实特异性.应用PCR方法从甜瓜基因组DNA中扩增出该基因自转录起始位点至上游一段长310 bp片段,并将其克隆到pUC 19载体中,序列分析表明该序列与已报道的相应序列完全相同,且具有TATA-box、CAAT-box、G-box、I-box-like和增强子元件TGTCACA等功能域,具有典型的果实特异性启动子特征.成功获得甜瓜果实特异性表达基因的启动子,为下一步实现外源基因在甜瓜果实中特异表达奠定基础.     

水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植物双元表达载体的构建

为克隆水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子,从GeneBank中找到了6组水稻中受硝酸盐诱导的特异cDNA片段,结合已发表的硝酸盐诱导的相关基因,经过序列比对确定特异片段所在的基因.电子克隆出对应基因的5′侧翼约1 500 bp的序列.以总DNA为模板利用PCR技术克隆出了对应的5′侧翼序列.经过测序分析,该序列具有许多启动子特征的顺式作用元件,加TA-box,CpG岛等.将这些启动子序列连接到pCAMBIA1391Z双元载体中,构建植物双元表达载体以进行启动子活性检测.     

青海牦牛与云南牦牛乳球蛋白基因5′调控区核苷酸序列同源性比较

利用一对PCR引物,寡聚核苷酸序列的上游引物为5-′gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3;′下游引物为5-′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后,分别克隆来自我国青海和云南地区牦牛的乳球蛋白基因的5′调控区1 447 bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆在pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明,青海牦牛该序列的核苷酸序列与文献报道的奶牛该基因的同源性为97.65%,云南牦牛该序列的核苷酸序列与奶牛该基因的同源性为96.8%,青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99.4%。     

PCR法克隆卤虫（Artemia franciscana） Artemin基因上游调控序列

利用限制性内切酶(Dra I和Hpa I)对卤虫(Artemia franciscana)基因组DNA进行酶切后，连上接头构建基因组“DNA文库”(即未克隆，带接头的DNA片段)，再以TD-PCR(Touch-down PCR)的方法扩增卤虫的Artemin．基因的上游调控序列，得到一段大为750bp的片段，将这一上游序列片段克隆到pMDl8-T载体中，以获得包括启动子、增强子等顺式作用元件在内的Artemin基因的上游调控序列，为进一步研究Artemin基因的表达模式及其功能提供依据。     

青海牦牛与云南牦牛乳球蛋白基因5''''调控区核苷酸序列同源性比较

利用一对PCR引物，寡聚核苷酸序列的上游引物为5’-gCg，AAT，TCA，TCC，CAC，gTg，CCT，gC-3’；下游引物为5’-gAg，AAT，TCC，Tgg，ggA，ggg，ACC，TT-3’。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后，分别克隆来自我国青海和云南地区牦牛的乳球蛋白基因的5’调控区1447bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMD1S-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明，青海牦牛该序列的核苷酸序列与文献报道的奶牛该基因的同源性为97．65％，云南牦牛该序列的核苷酸序列与奶牛该基因的同源性为96．8％，青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99．4％。     

黑子南瓜中STK类抗病基因同源序列的克隆及序列分析

 黑子南瓜是一种具有较强抗病性的葫芦科植物,依据所克隆的植物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因中的保守氨基酸序列合成相应的简并引物,从黑子南瓜基因组DNA中通过PCR克隆到了一些STK类的R-片段,经相关软件分析发现其中之一可以编码完整的氨基酸序列,可能来源于黑子南瓜中某个抗病或抗病相关基因.该基因片段与来源于其他已知基因的相应序列比较发现同源性都比较低,属于一个新的STK类R-片段家族成员.从黑子南瓜中克隆STK类片段,将为进一步从该植物材料中获得STK类抗病基因提供新线索.     

计算机辅助基因克隆的Oracle数据库系统

计算机辅助基因克隆的Oracle数据库系统利用SwissProt数据库获取已知的基因, 用 Blast程序从人类基因组序列中搜索与该基因同源的染色体DNA片段, 并将Blast返回的结果 存储于Oracle数据库. 使用者选择所感兴趣的Blast结果, 用本文所提供的算法及前端程序 合成这些DNA片段, 从而实现计算机辅助克隆新基因.     

大豆微粒体油酸盐脱饱和酶FAD2基因的克隆及其植物表达载体的构建

从大豆种子中提取RNA,通过逆转录PCR的方法扩增出1307bp的大豆微粒体油酸盐脱饱和酶FAD2基因,并将其克隆到pMD18-T vector,DNA测序分析表明克隆的片段与原序列相似性达到99.9%,蛋白质相似性达到100%,显示其与同科植物花生同源性最高,与其它植物FAD2的氨基酸序列同源性较低.实验室前期从锦橙中克隆了种子球蛋白基因启动子ssp,转化烟草证明具有种子特异性调控表达的特性.本研究利用ssp启动子和大豆的FAD2基因构建了在种子专一性启动子驱动下的植物表达载体p3300-ssp-FAD2-Tons,为进一步进行油料作物的脂肪酸基因工程奠定了基础.     

绵羊(0vis aries)线粒体DNA的遗传变异类型研究

通过PCR-RFLP和DNA序列测定发现绵羊线粒体基因组内存在的HinfⅠ酶切多态是COⅠ基因第234位的T-C碱基替换的结果.DNA序列分析表明该位点碱基的替换不导致氨基酸的改变,为一同义突变.依据这一单核苷酸多态可直接进行绵羊线粒体基因组的分型鉴定,并可作为绵羊核质基因互作研究、核外基因效应分析及转基因、动物克隆研究中胚胎及个体识别的分子标记.