灵芝漆酶的分离纯化及其部分酶学性质研究

将灵芝（Ganoderma lucidum）漆酶经过Sephadex G-75和DEAE-Sepharose Fast Flow两步纯化,获得具有3个同工酶的组分,并且纯度提高了81倍,酶活回收率高达83.9%。以ABTS为底物,漆酶最适pH值是2.2～2.6,在pH值4.6～7.8范围内稳定;最适温度45℃,在低于45℃时较稳定。大部分金属离子、酸根离子对灵芝漆酶普遍有抑制作用,除盐可以提高漆酶活力。     

木质素降解真菌粗毛栓菌(Trametes gallica)蓝色漆酶的分离纯化及性质研究

作者对粗毛栓菌(Trametesgallica)在PAG培养基条件下摇瓶培养产生漆酶的情况进行了研究.15d左右达到产酶高峰,随后进入平台期.对15d产生的漆酶进行分离纯化.4L发酵液经硫酸铵沉淀,DEAE SepharoseFastFlow柱层析和SephadexG 100柱层析,漆酶被纯化了36.9倍.经SDS PAGE验证为一条带,表观分子量约为60,000Da.纯化漆酶是一种含糖量6%的糖蛋白,且在605nm处具有蓝色漆酶Ⅰ型铜离子典型的吸收峰.以ABTS,DMP和愈创木酚为底物,反应的最适pH值分别为2.2,3.0和4.0;Km值分别为0.172×10-2,0.51,0.48mmol/L.以ABTS为底物,最适反应温度为70℃.在pH7～9处理24h,纯化漆酶仍保持较高活性.EDTA,卤素离子,NaCN和NaN3对酶活有抑制作用,其中NaN3是最强的抑制剂.纯化的蓝色漆酶不具有氨酸酶活性,但能够氧化非传统底物酚红.     

壳聚糖固定化云芝漆酶的制备及特性

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂制备固定化漆酶,测定了不同戊二醛浓度、交联时间、给酶量以及固定化时间对固定化漆酶活性的影响。结果表明,固定化反应的最佳条件为戊二醛浓度5%,交联时间8h,给酶量20mg/g载体,固定化时间6h,在此条件下制备的固定化漆酶酶活性保持率为52.2%。此固定化漆酶具有最大活性时的溶液pH值在4.5,相比于自由漆酶的最佳pH值5.0,其向酸性偏移;与自由漆酶相比,固定化酶有很好的稳定性和可重复使用性。     

改性离子交换树脂固定化漆酶及其动力学性质研究

环氧基改性的丙烯酸系树脂含环氧基,环氧基可在温和条件下与蛋白质上的亲核基团氨基反应而实现其固定化.研究了环氧基改性的离子交换树脂固定化漆酶的最优条件和固定化漆酶的酶学性质,结果表明,固定化漆酶时,在硫酸铵浓度为1.5mol·L-1、加酶量0.2U·g-1、pH 6.5、温度35℃条件下固定3h,测得固定化酶活性最好,比活力为0.026U·g-1,活力回收率为3.67%;该固定化酶催化反应的的最适温度为45℃,最适pH 4.5,米氏常数(Km)为1.233×10-3 mmol·L-1.锰离子、铁离子和钙离子在4×10-3~4×10-4 mol·L-1浓度之间时对固定化漆酶活性有抑制作用,在4×10-5~4×10-6 mol·L-1浓度之间时有激活作用.     

假单胞菌593多铜氧化酶CopA的漆酶活性研究

从假单胞菌593中克隆出多铜氧化酶copA基因,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3) p Lys S过量表达和纯化.纯化的CopA蛋白展示出漆酶活性,针对漆酶的3种底物ABTS、DMP、SGZ,CopA的最适反应pH分别是3. 5、7. 5和7. 5,最适反应温度分别是50℃、50℃和42℃.pH稳定性和热稳定研究发现,在pH 7. 0条件下,CopA比较稳定,在温度大于42℃保存该蛋白,其活性降低较快.二价金属离子影响实验发现,CopA漆酶活性能被二价铜离子显著加强.酶动力学常数实验结果展示,CopA作用于底物ABTS,K_m为0. 281 mmol/L,V_(max)为3. 02×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为1. 8 s~(-1); CopA作用于底物DMP,K_m为0. 141 mmol/L,V_(max)为4. 54×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为2. 2 s~(-1); CopA作用于底物SGZ,K_m为0. 025 mmol/L,V_(max)等于0. 7×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为0. 87 s~(-1).     

介孔SiO2固定化漆酶降解2,4DCP

以M-NH2-SiO2为载体,戊二醛为交联剂制备固定化漆酶,研究2,4-DCP(2,4-二氯苯酚)浓度、溶液酸度、温度对固定化漆酶降解2,4-DCP的影响.结果表明,固定化漆酶降解2,4-DCP最佳条件为:当2,4-DCP质量浓度为5mg.L-1,溶液pH为5.5,温度为30℃时,降解去除率为42.28%.固定化漆酶具有最大活性时的溶液pH值相比于自由酶的最佳pH向碱性偏移;与自由漆酶相比,固定化漆酶有良好的稳定性和重复使用性.     

不同来源重组漆酶的酶学特性

以来源于变色栓菌的同工酶LacA、LacB、LacC,杂色云芝的同工酶Lcc1、Lcc2,以及细菌ARA等6种重组漆酶为研究对象,比较了它们的最适反应温度、最适反应pH、温度稳定性、pH稳定性、动力学常数K_m,以及Cu²⁺对漆酶酶活的影响等酶学特性。结果表明:以邻联甲苯胺为底物时,LacA、LacB、LacC、Lcc1、Lcc2、ARA的最适反应温度分别为60、60、70、60、55和75 ℃; 以愈创木酚为底物时,6种漆酶的最适反应pH分别为5.0、5.0、4.5、5.0、4.5、7.0。LacA在催化ABTS、愈创木酚、邻联甲苯胺、丁香醛连氮以及2,6-二甲基苯酚时,其最适反应温度分别为55、70、60、20、65 ℃。此外,真菌漆酶在30～60 ℃,pH为2.5～7.0范围内都有较好的稳定性,细菌来源的漆酶在80 ℃下保持60 min,在pH=7.0时保持6 h仍具有较高的酶活力。Cu²⁺对细菌漆酶的激活作用要明显高于真菌漆酶。同时,以ABTS为底物时,K_m值最小,且不同来源漆酶的K_m值相差不大。因此,6种不同来源的重组漆酶在催化同一种底物时,酶学特性存在着差异性,同一种重组漆酶在催化不同底物时,其酶学特性也有较大差异。     

白毒鹅膏菌胞外漆酶的部分酶学性质研究

从威海市玛珈山上获得白毒鹅膏菌，在对其产酶条件研究的基础上，研究了pH值、温度、无机离子对白毒鹅膏菌漆酶活性和稳定性的影响，测定了漆酶的Km值。结果表明：Ba^2＋、Cu^2＋、、SO4^2-离子对漆酶有激活作用，而Ag^2＋、Cl^-、Fe^3＋离子则有抑制作用，该酶最适pH为4.6，在pH 5.0-5.4表现出较强的稳定性；最适反应温度为20℃，低于60℃时有较好的热稳定性；以邻联甲苯胺为底物的表观Km值为66.7μmol/L。     

漆酶对直接耐晒蓝B2RL脱色性能的研究

利用灵芝粗漆酶对直接耐晒蓝B2RL染液脱色,采用单因素逐一优化法确定其最适反应条件。结果表明：在pH值7．0、温度50℃、漆酶用量2u／mL、染料质量浓度150mg／L条件下,漆酶对直接耐晒蓝B2RL脱色反应4h后脱色率达到71．72％,反应24h后脱色率达到86．4％,脱色效果明显．研究为漆酶处理偶氮类染料废水提供了理论依据．     

灵芝液体发酵过程中检测指标的研究

采用液体发酵法研究了灵芝培养过程中发酵液pH值、菌丝体生物量、胞外胞内多糖含量及漆酶和羧甲基纤维素酶活性的变化规律,结果表明:菌丝体生物量、胞外胞内多糖含量及漆酶和羧甲基纤维素酶活性在整个培养过程中均呈先升后降趋势,pH值前3天下降,之后基本不变;菌丝体生物量、胞内多糖含量及漆酶和羧甲基纤维素酶活性具有相同时间效应和变化趋势,均在发酵4d后达到峰值.漆酶和羧甲基纤维素酶活性可以反映灵芝菌丝体生长状况,且相对于其它检测指标更为灵敏、简便,可用于发酵过程指示和控制.     

蜜环菌胞外漆酶酶活力的分光光度法测定

采用分光光度法测定密环菌（Armillaria mellea）胞外漆酶（Laccase）的活力,分别以2,2′－连氮－二（3－乙基苯并噻唑－6－磺酸）（简称ABTS）、丁香醛连氮、愈创木酚和邻联甲安为底物,比较了这4种底物对漆酸的敏感性,探讨了酶反应时间、温度、缓冲液及其pH值和底物与酶的用量等条件对漆酶催化反应的影响,实验结果表明,适宜的测酶条件可以确保漆酶活力的测定快速而准确。     

固定化灵芝漆酶脱色氨基黑反应体系优化

采用响应面分析法,对固定化灵芝漆酶(Lac)降解氨基黑10B脱色反应体系进行优化分析.首先采用单因素实验分别获取反应体系中6个影响脱色率因素的最佳值;然后通过Plackett-Burman设计法对选取的6个影响因素进行筛选,确定主要影响因素为ABTS浓度和Lac酶量;再用最陡爬坡实验逼近ABTS浓度和Lac酶量2个主要因素的最大响应区域,并通过中心组合设计和响应面分析,确定2个主要影响因素的最佳值.优化后的氨基黑10B脱色200μL反应体系为:pH值4.6、温度30℃、ABTS浓度0.07mmol·L-1、硫酸铜浓度1.75mmol·L-1、Lac酶量6.23mg、初始底物浓度100mg·L-1.该反应体系氨基黑10B脱色率可达60.02%,比单因素法脱色率提高了44.46%.     

EFFECT OF METAL IONS ON THE LACCASE ACTIVITY

The effects of five metal ions(Fe2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+) on ABTS oxidation catalyzed by laccase were studied under condition of pH=4.5 by spectrophotometer. The results show that Fe2+ ion has obvious effect on the activity and the nature of inhibition is competitive type. It is found that the inhibition is realized through the reduction ofABTS.by Fe2+ ion. Other metal ions have slight influence on laccase activity.     

TREATMENT OF SWEET GUM LIGNIN BY LACCASE AND LMS

INTRODUCTIONLaccaseisakindofcopper-containingoxidase熏whichwidelydistributesinplantsandmostfungi.Laccasecancatalyzetheoxidationofphenolicsubstances熏soitiswidelyusedinmanyfieldssuchaschemical熏environmental熏biologicalandpapermakingetc.laccaseInpapermakin…     

漆酶与各种类型底物反应性能的微量热法研究

在厌氧条件下，用ＬＫＢ－２１０７Ｂａｔｃｈ微量热系统研究了在２９８．１５Ｋ０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲溶液（ｐＨ７．４）中漆树漆酶与５种底物的反应，测定了各反应的反应焓变△Ｈｍ米氏常数Ｋｍ，酶底复合过程的吉布斯自由能△Ｇ０复合物中电子转移速率常数ｋ２，以及漆病对各种底物的催化活性ＥＡ．讨论了相同的实验条件下，各种酶底复合物的稳定性，底物官能团及其位置对酶反应中的电子转移速率和非酶反应中自由基聚合形式     

灵芝固态发酵产漆酶及对秸秆木质素的降解

为探索木质素的生物降解新途径,采用平板显色法从三株白腐真菌中筛选出一株灵芝属漆酶高产菌,以农作物秸秆等为培养基进行固态发酵,该菌主要产漆酶和少量木质素过氧化物酶.在优化条件下,该菌发酵18d,漆酶活力最高达2056U/g干曲.该菌以玉米秸秆、油菜秸秆及稻草作为唯一营养源固态发酵30d,对玉米秸秆的木质素降解率最大,达到23.7%,油菜秸秆也达到了16.2%.     

陶瓷-壳聚糖复合材料固定真菌漆酶

以陶瓷为第一载体,壳聚糖为二次载体,戊二醛为交联剂,采用共价结合和吸附联用法制备固定化漆酶。考察了漆酶固定化的影响因素,并对固定化漆酶的性质进行了研究。结果表明,漆酶固定化的适宜条件为0.15g壳聚糖-陶瓷复合载体,加入3mL 1.25?mg/mL漆酶磷酸盐缓冲溶液（0.1mol/L, pH4.0）,在4℃固定24h。酶的固定化效率是51.0%,固定化酶的酶活是55.87U/g,最适pH为3.0,最适温度分别为25℃和50℃。该固定化酶具有良好的贮存和操作稳定性。在pH3.0,温度25℃时,固定化酶对2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐的表观米氏常数为66.64μmol/L。