具有真细菌基因启动子活性的古生菌DNA片段

以大肠杆菌启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体经三亲本杂交用４组限制性内切酶分别消化古生菌盐生盐杆菌Ｒ１的染色体ＤＮＡ,在体外进行重组,转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ－５α感受态细胞,得到１２个转化子（Ｔ１￣和２）,其抗性水平分布在１０￣５００ｍｇ／Ｌ的区间内,将这些转化子所含质粒分别命名为ＰＳＸ１￣ＰＳＸ１２,限制性酶切分析表明,这些质粒各插入了一段不同的外源ＤＮＡ片段,杂交分析表明,抗性最强的转化子Ｔ１     

盐藻启动子活性片段的克隆及序列分析

报道了以启动子探测质粒pECE7为载体克隆盐藻（Dunaliella salina)中具有启动子活性DNA片段的研究。经限制性内切酶EcoR I分别消化盐藻基因组DNA和质粒pECE7,并进行体外重组及转化筛选，得到一具有启动子活性的DNA片段Ped。经进一步氯霉素抗性筛选，证明此启动子具有较高的活性。测序结果显示Ped长243bp。对其序列分析表明它具有启动子初级结构的基本特征。Southern杂交显示此启动子片段确实来自于盐藻基因组，且其广泛存在于整个基因组中启动盐藻基因的表达。经推测，Ped中含有多种转录因子结合位点的同源序列，因此Ped可能参与了多基因表达的调控。     

一株耐盐细菌的鉴定及其耐盐性的初步研究

从皖北砀山盐碱地中分离到一株耐盐细菌,该菌在肉汤培养基上可耐盐至7％,在基本培养基上可耐至3％．革兰氏阳性杆菌,具芽孢,芽孢表面有明显纵状突起。孢囊膨大,周生鞭毛,接触酶阳性,65℃不生长,可以葡萄糖为底物产酸产气,G C含量为52．7mol％,根据以上特性,检索鉴定该菌为浸麻芽孢杆菌(B．macerans)并对其质粒进行了提取和消除实验,证明质粒大小约为t3Kb。耐盐性状与质粒关系不大．同时对菌体裂解物作了SDS—PAGE凝胶电泳,证实在高盐(5％)情况下比低盐(0．5％)情况下的电泳图谱多出一条蛋白质带．此外还研究了耐盐性与培养基成分之间的关系．     

耐碱细菌NTT36耐碱基因的克隆及表达产物的分析

耐碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６总ＤＮＡ经ＥｃｏＲ１酶不完全消化,与质粒ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＲＩ酶切产物在体外重组后,转化大肠杆菌ＨＢ１０１,在碱性平板上直接筛选耐碱转化子,转化经检测具有氨苄青霉素抗体,分析表明转化子具有１５ｋｂ大小的重组质粒,用此重组质粒转化大肠杆菌ＨＢ１０１,ＤＨ５ａ和ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,均产生大量同时具有耐碱性和Ａｍｐ抗性的转化子,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和点杂交证明此重组质粒（定名为     

钝齿棒杆菌YL_1基因文库的建立及异亮氨酸基因在大肠杆菌中的克隆表达

以ｐＵＣ１９质粒为载体建立了异亮氨酸产生菌钝齿棒杆菌（Ｃｏｒｙｍｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ）ＹＬｌ的基因文库，并通过酶切重组子、斑点杂交得到证实．共筛选５８００个重组子，一个特定ＤＮＡ片断在库中存在的可靠性达９９．９９％．从中克隆重组了带有ｉｌｖＡ基因片断的重组质粒ｐＹＩ９４，转化ＡＨＶ的大肠杆菌ＥＤ８６５４－５，使本来不产Ｉｌｅ的大肠杆菌可以积累Ｉｌｅ１．５ｇ／Ｌ，为进一步高效表达构建工程菌创造了条件．     

亮氨酸拉链结构蛋白基因表达载体选择

以ZG1( )、ZG1(-)、ZG2( )、ZG2(-)、ZG3( )、ZG3(-)寡聚核苷酸片段为材料，合成了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA必需的35个氨基酸的折叠片段，将此片段分别克隆到pET3b质粒和pBLZ质粒中．酶切后用2％琼脂糖电泳检测证明两者克隆成功．将这2种重组质粒分别转化到E.coli DH5a中．发现pET3b重组体在E．coli DH5a中表达成功．而pBLZ质粒重组体在E．coli DH5a中不能成功表达；从转化子中分离得到重组质粒pET3b,酶切和序到分析都证明插入序列为合成的亮氨酸拉链蛋白基因．     

多杀性巴氏杆菌幽灵的研究

采用基因工程方法,将PhiX174噬菌体裂解基因E和温敏控制表达系统与质粒pPBA1100基因杂交,构建了重组子pPBA1100-E.将重组子转化到多杀性巴氏杆菌中,通过温度诱导使裂解基因表达.用限制性内切酶检验重组子.扫描电镜观察多杀性巴氏杆菌细菌幽灵和菌落形成单位评价遗传灭活率.结果表明:重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定,琼脂糖电泳呈现三条谱带,相对分子质量与理论值一致.扫描电镜观察显示,重组子在多杀性巴氏杆菌中成功表达,获得了细菌幽灵.菌落形成单位检验结果显示,多杀性巴氏杆菌遗传灭活率达到99%.     

5’端与3’端间同源长度对质粒构建的影响

5’端/3’端间同源长度对分子内同源重组质粒构建的影响还不明确.本研究以与GFO对应的五种反向引物CR1、CR2、CR3、CR4、CR5,分别扩增5’端/3’端间同源长度有10、20、30、40、50 bp的5.9 kb线性质粒pET20b-C2-GH10-C2作为模式DNA,经重组酶Exnase Ⅱ 37℃体外重组30 min,42℃热激诱导转化BL21(DE3)感受态细胞,比较转化率、质粒位置正确率、接口正确率.结果显示,同源长度30 bp DNA重组后转化子正确质粒最多,正确接口转化率3.4个/ng DNA,其次是同源长度20 bp DNA.电泳检测显示DNA重组后产生nick质粒,是转化子的来源,胞内酶修饰nick可产生基因-载体接口异常.     

短小芽孢杆菌质粒pCJ3的衍生质粒pAl32的酶谱及抗性基因定位

从短小芽孢杆菌四环素抗性质粒pCJ3截短的衍生质粒pAL32,经用6种限制酶双酶解试验,根据琼脂糖凝胶电泳带估算各片段的分子量,作出了pAL32的6种限制酶图谱。利用已除去复制功能的金黄色葡萄球菌质粒pUB110与pAL32构建的Km~rTc~r的双抗性重组质粒pSC33为载体,在EcoRV位点克隆的λDNA片段的重组子均为Km~rTc~s。用pUB110与pAL32在PvuⅡ位点连接后的重组质粒也为Km~rTc~s。根据这些重组子四环素抗性的失活,推知pAL32上EcoRV与PvuⅡ切点均位于其四环素抗性基因上。     

环状芽胞杆菌（Bacilluscirculans）的转化和中性蛋白酶基因的表达

用枯草芽胞杆菌质拉载体ｐＮＱ１２２和含有中性蛋白酶基因的重组质粒ｐＭＰＲ８转化环状芽胞杆菌Ｃ－２，转化频率为１．０×１０３转化子／μｇＤＮＡ．含有ｐＭＰＲ８的转化子能在酪蛋白平板上形成清晰的水解圈，其蛋白酶活性与相同质粒转化枯草杆菌ＤＢ１０４所得酶活性相近．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证实了转化细胞中存在质粒ｐＮＱ１２２和ｐＭＰＲ８，两种质粒在该菌中的稳定性差别很大．